PTEN通過負調節(jié)PI3K/AKT信號通路下調內皮素受體B抑制內皮素-1引起的肝星狀細胞活化

李乃樹

南方醫(yī)科大學

摘要：[背景]肝纖維化是繼發(fā)于各種慢性肝臟疾病之后反復的創(chuàng)傷愈合與瘢痕修復過程,其主要病理生理學特征是細胞外基質(Extrcellular matrix,ECM)的生成與降解失衡,引起ECM的大量沉積,zui終導致肝纖維化。肝纖維化的過程可逆,不能有效控制肝纖維化必然導致肝硬化,zui終出現肝癌甚至肝功能衰竭。肝纖維化是多種細胞與細胞因子相互作用的結果,其中,肝星狀細胞(hepatic slate cells, HSCs)已經被證實為引起肝纖維化的主要細胞,其活化和增殖是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的關鍵事件。正常情況下,HSCs處于靜止狀態(tài),主要功能為儲存Vitamin-A,因此也被稱為儲脂細胞。當肝臟受損傷時,HSCs在多種炎癥反應因子的作用下被激活并轉化為肌成纖維樣細胞進而產生大量ECM,導致肝纖維化的發(fā)生。HSCs激活的過程受多種信號物質及信號通路的調控,但其具體機制仍未被*闡明。內皮素—1(endothelin-1,ET-1)是迄今為止發(fā)現的強的一種調節(jié)血管收縮的活性肽,在正常個體的血管張力調節(jié)過程中發(fā)揮著重要的作用。同時,ET—1也與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關,包括刺激細胞的發(fā)育和增殖、參與創(chuàng)傷愈合反應和組織纖維化過程。近年來,針對ET—1與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展,尤其是HSCs的活化和增殖方面已開展了廣泛的研究。正常情況下,肝組織內肝血竇內皮細胞和HSCs可以產生ET—1,在肝臟損傷的情況下,HSCs成為ET—1分泌的主要細胞,且ET—1通過作用于HSCs表面表達的ET受體(endothelinreceptor,ETR)啟動HSCs的激活程序。ET—1可通過作用于HSCs上的ET—1受體,即ETAR(endothelin A receptor,ETAR)或ETBR(endothelin B receptor, ETBR),引起HSCs活化增殖和DNA合成,從而促進膠原與蛋白多糖合成增加、纖維組織增生、損傷修復的加速。眾多的研究結果顯示ET—1在肝纖維化的病理生理過程中發(fā)揮重要作用,但ET—1作為一種調節(jié)因子在HSCs的激活、增殖及ECM沉積的過程中作用的確切機制仍未*明確。10號染色體缺失的磷酸酶與張力蛋白同源基因(phosphate and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)作為一種抑癌基因,它同時具有蛋白磷酸酶和脂質磷酸酶活性,PTEN基因的缺失或突變已在包括原發(fā)性肝癌在內的許多終末期腫瘤中發(fā)現。近年來,關于PTEN的研究已經從肝臟腫瘤領域轉移至肝臟非腫瘤性疾病,且已有文獻報道PTEN與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關。研究發(fā)現,纖維化肝組織中PTEN的表達下降,PTEN的表達隨著肝纖維化進展而減少,且在體外環(huán)境中PTEN基因的表達與HSCs的活性及增殖能力成負相關。因此,調節(jié)PTEN在HSCs中的表達可能會影響HSCs的活化及增殖進而影響肝纖維化的進展綜上所述,ET—1可以啟動HSCs的活化程序,但是PTEN可以通過一定的信號通路抑制HSCs的活化過程,二者在HSCs活化過程中的作用及其機制仍有待進一步研究。[目的]為了進一步探討ET—1及PTEN在HSCs激活方面的作用,本實驗通過研究過表達PTEN的HSC-T6在外源性ET—1的刺激下所產生的效應,并應用PI3K/AKT信號通路的特異性抑制劑LY294002模擬PTEN對PI3K/AKT信號通路的阻斷作用,探討PTEN是否能夠通過負調節(jié)PI3K/AKT信號通路下調ETBR的表達從而抑制ET—1引起的HSCs的激活。[方法]①、實驗分組本實驗按以下分組方式進行：1、P組,PTEN轉染HSC-T6+ET-1組;2、V組,空載PTEN的vector轉染HSC-T6+ET-1組；3、PBS+ET-1空白對照組；4、L+V組,空載PTEN的vector轉染HSC-T6+ET-1+L Y294002組;5、PBS+ET-1+LY294002組。②、細胞培養(yǎng)大鼠肝星狀細胞系HSC-T6購自廣東科學院,細胞培養(yǎng)在含10%胎臺牛血清、100 IU/m青霉素、和100mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,并在37℃含5%C02的培養(yǎng)箱中孵育。③、細胞瞬時轉染在轉染前24小時,指數級生長的HSC-T6以每孔2×105的濃度接種于6孔板,待細胞鋪滿70%—80%的培養(yǎng)孔時開始轉染。PTEN及空載PTEN的vector采用lipofectamine 2000,根據試劑盒說明,以zui終100nM的濃度轉染進入HSC—T6,并設置PBS為空白對照組。轉染穩(wěn)定后各組加入10-7mol/L ET-1,12h在L+V組及L+PBS組加入50uM/L LY294002, ET-1作用48h后檢測各指標的蛋白質及基因水平的表達。④、蛋白質免疫印跡法(western blot)a-SMA, ETBR及ETAR的蛋白表達水平采用western blot方法檢測。經ET-1作用48h后,收集細胞樣品,加入相應體積的含有1%Nonidet P-40,0.5% sodium deoxycholate,0.1%sodium dodecyl sulfate和蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液,冰上放置30 min,然后4℃,12 000 r/min離心10 min,吸出上清,得到總蛋白樣品。樣品蛋白質采用BCA蛋白定量試劑盒定量。調整樣品蛋白質濃度使其接近,保證每個樣品孔蛋白質上樣量一致.蛋白質經10% SDS-PAGE電泳后轉移至PVDF膜上(MILLIPORE)。PVDF膜以5%脫脂奶粉封閉1h后,加入一抗4℃過夜。在此過程中所用到的抗體a-SMA (1;1000 dilution, Santa Cruz Inc), ETBR (1:1500 dilution; Santa Cruz Inc.), ETAR (1; 1500 dilution; Santa Cruz Inc), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (1:1000 dilution; Shanghai Sangon Biotech)。取出PVDF膜,經洗滌后,再加入HRP標記的二抗(1:4000 dilution,Fude Biotech),室溫下孵育1h。每步反應結束均用PBST洗滌3次,每次10 min。zui后用ECL化學發(fā)光3-5min,使用Odyssey成像系統(tǒng)掃膜。結果以目的蛋白與GAPDH吸光度的比值表示。⑤、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)ET-1作用后48h,采用Trizol(Invitrogen)試劑盒,按說明提取細胞總RNA。將RNA提取物1ug,逆轉錄為cDNA,并置于-80℃保存?zhèn)溆谩＝?0ul的PCR反應體系包括：cDNA,上下游引物、2x SYBR Green qPCR SuperMix、以及dH2O。采用LightCycler 480IISystem進行PCR擴增,建立zui適的PCR反應體系,擴增相應的產物。β-actin被用作內參。ETAR引物序列：上游5’-TCTGATGACCTC GGTCCC-3’,下游5’-GTTCATGCTGTCCTTATGGCT-3’,ETBR引物序列：上游5’-AATTACGATGGACTACAAAGGAAGTTA-3’,下游5’-GCAAGCAGAAATAGA AACTGAATAGC-3’.β-actin引物序列：上游5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’,下游5’-CAGCGGAACCGCTC ATTGCCAATGG-3’。[統(tǒng)計學分析]所有數據以均數±標準差(x±s)表示。采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計分析。組間均數差異性比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。[結果]1、ET—1作用后各組各指標的變化①、ET—1作用后各組α-SMA的表達變化Western blot檢測結果顯示,10-7 mol/L外源性ET—1作用于各組HSC—T6后,P組α-SMA的相對表達量為(0.35±0.01),明顯低于V組(0.46±0.01)及PBS組(0.46±0.01)(p<0.05),差異有統(tǒng)計學意義。②、ET—1作用后各組ETBR的表達變化Western blot檢測結果顯示,10-7mol/L外源性ET—1作用于各組HSC—T6后,ETBR蛋白的相對表達量在P組為(0.42±0.01)顯著低于V組(0.85±0.01)及PBS組(0.83±0.01),(p<0.05),差異有統(tǒng)計學意義。qRT-PCR結果顯示,10-7mol/L外源性ET—1作用于各組細胞后,ETBR mRNA的相對表達量在P組為(0.63±0.06)顯著低于對照組(V組：1.61±0.13,PBS組：1.50±0.03)(p<0.05),差異有統(tǒng)計學意義。③、ET—1作用后各組ETAR的表達變化Western blot檢測結果顯示,10-7mol/L外源性ET—1作用于各組HSC—T6后,ETAR蛋白的相對表達量在P組為(0.22±0.01)與V組(0.22±0.01)及PBS組(0.22±0.01)無明顯差異。qRT-PCR結果顯示,10—7mol/L外源性ET—1作用于各組細胞后,ETAR mRNA的相對表達量在P組為(0.46±0.01),V組(0.46±0.01),PBS組(0.46±0.01), (p>0.05),各組之間差異無統(tǒng)計學意義。2、LY294002作用后各組各指標的變化①、LY294002作用后各組α-SMA的表達變化Western blot檢測結果顯示,LY294002作用于各組HSC-T6后,α-SMA的相對表達量在L+V組及L+PBS組為(0.34±0.01,0.34±0.01),顯著低于V組及PBS組α-SMA的表達(p<0.05),但與P組α-SMA的表達無顯著差異(p>0.05)。②、LY294002作用后各組ETBR的表達變化Western blot檢測結果顯示,LY294002作用于各組HSC-T6后,ETBR蛋白的相對表達量在L+V組及L+PBS組為(0.43±0.01,0.44±0.01),顯著低于V組及PBS組(p<0.05),但與P組ETBR蛋白的相對表達無顯著差異(p>0.05)。qRT一PCR結果顯示,ETBR mRNA的相對表達量在L+V組及L+PBS組為(0.65±0.02,0.64±0.01),顯著低于V組ETBR mRNA的表達(p<0.05),但與P組ETBR的表達無顯著差異(p>0.05)。③、LY294002作用后各組ETBR的表達變化Western blot檢測結果顯示,LY294002作用于各組HSC-T6后,ETAR蛋白的相對表達量在L+V組及L+PBS組為(0.22±0.02,0.23±0.01),與P組、V組及PBS組ETAR蛋白的相對表達量無明顯差異(p>0.05)。qRT-PCR結果顯示,ETAR mRNA的相對表達量在L+V組及L+PBS組為(0.45±0.02,0.46±0.01),與P組、V組及PBS組ETAR mRNA的相對表達量無明顯差異(p>0.05)。[結論]PTEN通過負調節(jié)PI3K/AKT信號通路下調ETBR而非ETAR的表達從而抑制ET—1引起的HSCs的活化。 還原

關鍵詞：肝纖維化; 肝星狀細胞; PTEN; 內皮素-1;

導師：林建華;

分類號：R575.2