Y1HGold Chemically Competent Cell

產(chǎn)品規(guī)格 

Y1HGold Competent Cell:                                  100μl/支              保存： -80℃（3個(gè)月）

pGADT7 (control vector, 10 ng/μl)                           10μl              保存：-80℃（12個(gè)月）

Carrier DNA (10 μg/μl)                                            100μl              保存：-20℃（12個(gè)月）

PEG/LiAC:                                                                    5ml              保存：    4℃（12個(gè)月）

基因型

MATα, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4Δ, gal80Δ, met-, MEL1

Y1HGold Chemically Competent Cell產(chǎn)品說(shuō)明

Y1HGold菌株是Clontech公司開發(fā)的GAL4-AbA酵母單雜系統(tǒng)用菌株，MATα型，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進(jìn)行篩庫(kù)試驗(yàn)。Transformation marker為：ura3，leu2；報(bào)告基因?yàn)椋?em>AbAr。Y1HGold-GAL4-AbA 酵母單雜系統(tǒng)需要兩種質(zhì)粒配套使用：pAbAi 和PGADT7。質(zhì)粒pAbAi的篩選標(biāo)志為URA，用于表達(dá) pBait-AbAi construct (1~3個(gè)bait DNA序列重復(fù)串聯(lián)后克隆到pAbAi中)；質(zhì)粒pGADT7的篩選標(biāo)志為L(zhǎng)EU，用于表達(dá)AD(GAL4 C端768~881位氨基酸)與目標(biāo)蛋白 (Prey)的融合蛋白。GAL4-AbA酵母單雜系統(tǒng)原理：Aureobasidin A (AbA)是一種環(huán)酯肽抗生素，在低濃度 (0.1-0.2 µg/ml)下即可對(duì)酵母產(chǎn)生毒性?；蚪M中整合了pBait-AbAi 的酵母菌株 (Bait-Reporter Yeast Strains)，當(dāng)獵物蛋白 (Prey)結(jié)合到誘餌序列 (Bait DNA)上，GAL4 AD就會(huì)激活A(yù)bAr的表達(dá)，從而能夠在含有抗生素AbA 的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。AbAr與營(yíng)養(yǎng)缺陷報(bào)告基因相比具有更低背景的優(yōu)點(diǎn)，可以降低酵母單雜假陽(yáng)性發(fā)生的概率。Y1HGold感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，-80℃可保存三個(gè)月，pGADT7質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>10⁴ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 取pBait-AbAi質(zhì)粒5µg，BstBI或 BbsI酶切1小時(shí)，回收。

2. 取100 μl冰上融化的Y1HGold感受態(tài)細(xì)胞，依次加入預(yù)冷的線性pBait-AbAi質(zhì)粒1-5 µg（體積不高于15 µl），Carrier DNA (95-100度5 min,快速冰浴，重復(fù)一次) 10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打幾次混勻，30度水浴30 min (15 min時(shí)翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。

3. 將管放42℃水浴15 min (7.5 min時(shí)翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。

4. 5000 rpm離心 40 s棄上清，ddH₂O 400 µl 重懸，離心 30s棄上清。

4. ddH₂O 50 µl重懸，涂SD/-Ura平板，29℃培養(yǎng)72 h。

5. 挑取5-10個(gè)克隆，用PCR方法確定pBait-AbAi 整合到Y(jié)1HGold 基因組中，PCR 陽(yáng)性菌株在SD/-Ura平板劃線，29℃培養(yǎng)72 h，4℃保存，此菌株即是Y1HGold[Bait/AbAi] 菌株。

注意事項(xiàng)

1. 感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化。

2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少終用于涂板的菌量。

3. 同時(shí)轉(zhuǎn)化2-3種質(zhì)粒時(shí)可增加質(zhì)粒的用量。

4. Y1HGold酵母菌株對(duì)高溫敏感，適生長(zhǎng)溫度為27-30℃；高于31℃，生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。

5. 菌落變粉不是污染，是酵母細(xì)胞生長(zhǎng)中一個(gè)常見現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞在平板培養(yǎng)幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過(guò)自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產(chǎn)物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在細(xì)胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。

6. 酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度比YPDA培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長(zhǎng)越慢，以轉(zhuǎn)化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克?。煌縎D單缺平板29℃，48-60 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆。