Y187 Chemically Competent Cell

產(chǎn)品規(guī)格

Y187 Competent Cell:                                         100μl/支              保存： -80℃（3個月）

pGADT7 (control vector, 10 ng/μl)                           10μl              保存：-80℃（12個月）

Carrier DNA (10 μg/μl)                                            100μl              保存：-20℃（12個月）

PEG/LiAC:                                                                    5ml              保存：    4℃（12個月）

基因型

MATα, ura3-52, his3-200, ade 2-101, trp 1-901, leu 2-3, 112, gal4Δ, met-, gal80Δ, URA3::GAL1_UAS-GAL1_TATA-lacZ, MEL1

Y187 Chemically Competent Cell產(chǎn)品說明

Y187菌株是Clontech公司開發(fā)的GAL4系統(tǒng)酵母單雜，雙雜實驗用菌株，MATα型，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)?；蚺cMATa型酵母菌株 (Y2HGold，AH109等)通過mating操作進(jìn)行篩庫試驗。Transformation marker為: trp1, leu2，報告基因為：lacZ，MEL1。Y187-GAL4酵母雙雜系統(tǒng)需要兩種質(zhì)粒配套使用：pGBKT7和pGADT7。質(zhì)粒pGBKT7的篩選標(biāo)志為TRP1，用于表達(dá)DNA-BD (來自酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4N端1~174位氨基酸)與目標(biāo)蛋白 (Bait)的融合蛋白；質(zhì)粒pGADT7的篩選標(biāo)志為LEU，用于表達(dá)AD (GAL4 C端768~881位氨基酸)與目標(biāo)蛋白 (Prey)的融合蛋白。GAL4系統(tǒng)原理：一個完整的酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4可分為功能上相互獨(dú)立的兩個結(jié)構(gòu)域：位于N端1~174位氨基酸區(qū)段的DNA結(jié)合域 (DNA-BD)和位于C端768~881位氨基酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域 (AD)。DNA-BD能夠識別GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并與之結(jié)合。而AD可以啟動UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。BD和AD單獨(dú)存在不能激活轉(zhuǎn)錄，但當(dāng)二者接近時，則呈現(xiàn)完整的GAL4活性，使含有UAS的啟動子下游基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。正常條件下，BD不與AD結(jié)合，將要檢測的蛋白質(zhì)分別與BD和AD融合，形成 bait融合蛋白 (bait –BD)和 prey融合蛋白 (prey-AD)，如果 bait和 prey發(fā)生相互作用，就會促使 BD和 AD的相互接近，形成完整的GAL4，從而激活報告基因的轉(zhuǎn)錄。Y187有兩個報告基因：lacZ，MEL1，分別由兩種不同的啟動子 (G1，M1)啟動，這兩種啟動子只有GAL4識別的17 bp核心區(qū)相同，其余部分均不同，大大降低了酵母雙雜假陽性發(fā)生的概率。Y187感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，-80℃可保存三個月，pGADT7質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>10⁴ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 取100 µl冰上融化的Y187感受態(tài)細(xì)胞，依次加入預(yù)冷的目的質(zhì)粒2-5 µg，Carrier DNA (95-100度5 min，快速冰浴，重復(fù)一次）10 µl，PEG/LiAc 500µl并吸打幾次混勻，30度水浴30 min (15 min時翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。

2. 將管放42℃水浴15 min (7.5 min時翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。

3. 5000 rpm離心 40 s棄上清，ddH₂O 400 µl 重懸，離心 30s棄上清。

4. ddH₂O 50 µl重懸，涂板，29℃培養(yǎng)48-96 h。

注意事項

1. 感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化。

2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應(yīng)減少終用于涂板的菌量。

3. 同時轉(zhuǎn)化2-3種質(zhì)粒時可增加質(zhì)粒的用量。

4. Y187酵母菌株對高溫敏感，適生長溫度為27-30℃；高于31℃，生長速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。

5. 菌落變粉不是污染，是酵母細(xì)胞生長中一個常見現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞在平板培養(yǎng)幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產(chǎn)物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在細(xì)胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。

6. 酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長速度比YPDA培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長越慢，以轉(zhuǎn)化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克??；涂SD單缺平板29℃，48-60 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆。