牛結(jié)節(jié)疹病毒探針法熒光定量PCR試劑盒

Bovine Lumpy Skin Disease Virus(LSDV)

產(chǎn)品及特點(diǎn)

牛結(jié)節(jié)疹病毒(Lumpy skin disease virus，LSDV)又牛疙瘩皮膚病毒或牛結(jié)節(jié)性 皮膚病病毒，該病毒的代表株是 Naethling 株，因此又叫 Naethling 病毒。該病毒 形態(tài)與牛痘苗病毒相似，它引起的以患牛發(fā)熱,皮膚、黏膜、器官表面廣泛性結(jié)節(jié)，淋 巴結(jié)腫大，皮膚水腫為特征的傳染病，后感染動物消瘦，產(chǎn)乳量大幅度降低，嚴(yán)重時(shí) 導(dǎo)致死亡。該病起源于非洲，2010 年以來，確認(rèn)在此期間曾發(fā)生或正在發(fā)生該病的國 家多達(dá) 43 個(gè)，分布于非亞歐三大洲，其中非洲疫情尤為嚴(yán)重。隨著我國與非洲國家交 往的不斷加強(qiáng)，貿(mào)易范圍不斷擴(kuò)大，該病傳入我國的風(fēng)險(xiǎn)不斷加大，因此掌握該病 的流行狀況、開展相應(yīng)的診斷檢測技術(shù)研究以及制訂相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)不僅十分必要而且迫 在眉睫。本產(chǎn)品就是為此目的根據(jù)探針法 qPCR 原理開發(fā)的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)： 

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 根據(jù)牛結(jié)節(jié)疹病毒保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，能專一性地檢測出樣品中的牛結(jié)節(jié)疹 病毒成分，但不能檢測其他非牛結(jié)節(jié)疹病毒成分。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 一管式閉管操作，降低了交叉污染。

5. 快速，整個(gè)檢測過程（按一個(gè)樣品計(jì)）所需時(shí)間僅為 2.0 小時(shí)。

6. 本只能用于科研，足夠 50 次 20uL 體系的探針法熒光定量 PCR。

牛結(jié)節(jié)疹病毒探針法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。使用本試劑盒提供的陽性對照時(shí)，由于其濃度較 高，一定要注意不要污染其他試劑和成分。在專門的區(qū)域操作。  

自備試劑 DNA 模板 

使用方法 一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。 由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 模板稀釋液，用帶芯槍 頭，下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 RNA 的制備

7. 如果有 N 個(gè)樣品，設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性 對照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。

三、Probe qRT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè) 用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對照（用 水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模 板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)）： 

四、qPCR 反應(yīng)參數(shù)

五、數(shù)據(jù)處理

11. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

12. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等 于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為 陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則 為陰性，如果小于 40，則為陽性。