Human AAHA ELISA Kit

特別說(shuō)明： 
*: [96T/48T]（打開包裝后請(qǐng)及時(shí)檢查所有物品是否齊全完整） 
#: 一周內(nèi)使用可存于4℃，需長(zhǎng)時(shí)間存放或多次使用建議存于-20℃. 
相關(guān)試劑在分裝時(shí)會(huì)比標(biāo)簽上標(biāo)明的體積稍多一些，請(qǐng)?jiān)谑褂脮r(shí)量取而非直接倒出！ 
Human AAHA ELISA Kit檢測(cè)原理: 
本試劑盒采用雙抗原夾心ELISA法。用抗原包被于酶標(biāo)板上，實(shí)驗(yàn)時(shí)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的人AAHA
會(huì)與包被抗原結(jié)合，游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗原和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和
素。生物素化的抗原與結(jié)合在包被抗原上的人AAHA結(jié)合、生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免
疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過(guò)氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍(lán)色，
加終止液后變成黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值，AAHA濃度與OD450值之間呈正比，通
過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中AAHA的濃度。 
Human AAHA ELISA Kit樣品收集: 
1. 血清：全血樣品于室溫放置2小時(shí)或4℃一夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，收集
血液的試管應(yīng)為一次性的無(wú)熱原，無(wú)內(nèi)毒素試管。 
2. 血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘，取上清即可
檢測(cè)。避免使用溶血，高血脂樣品。 
3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)
影響測(cè)量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體
積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。
推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組
織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。zui后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，
取上清檢測(cè)。 
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：取細(xì)胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測(cè)。 
5. 其它生物樣品：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)  
6. 樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。 
7. 樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可保存于4℃，若不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍
存于-20℃(1個(gè)月內(nèi)檢測(cè))，或-80℃（6個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），避免反復(fù)凍融。 
8. 如果您的樣品中檢測(cè)物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品zui高值，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋（建議先
做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定稀釋倍數(shù)）。 
試驗(yàn)所需自備物品: 
1. 酶標(biāo)儀(450nm波長(zhǎng)濾光片) 
2. 高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL 
3. 37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水 
4. 吸水紙 
檢測(cè)前準(zhǔn)備工作: 
1. 請(qǐng)?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。 
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)
晶，屬于正常現(xiàn)象，可用40℃水浴微加熱使結(jié)晶*溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超
過(guò)50℃，使用時(shí)洗滌液應(yīng)為室溫）。當(dāng)日使用。 
3. 標(biāo)準(zhǔn)品: 于10000×g離心1分鐘，加入標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，旋緊管蓋，
靜置10分鐘，上下顛倒數(shù)次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為200ng/mL）。
然后根據(jù)需要進(jìn)行倍比稀釋（注：不要直接在反應(yīng)孔中進(jìn)行倍比稀釋）。建議配制成以下濃
度：200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、0ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液直接作為空白孔
0ng/mL。如配制100ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5mL200ng/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5mL標(biāo)準(zhǔn)品&
樣品稀釋液的EP管中，混勻即可，其余濃度依此類推。  
4. 生物素化抗原工作液：實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量（以100μL/孔計(jì)），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配
制100-200μL。使用前15分鐘，以生物素化抗原稀釋液稀釋濃縮生物素化抗原(1:100)成工作
濃度。當(dāng)日使用。 
5. 酶結(jié)合物工作液：實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量（以100μL/孔計(jì)），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制
100-200μL。使用前15分鐘，以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結(jié)合物(1:100)成工作濃度。
當(dāng)日使用。 
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法圖例：（以500μL/管為例，也可根據(jù)實(shí)際用量來(lái)稀釋，如200μL/管）