ELISA試劑盒試驗(yàn)常見問(wèn)題簡(jiǎn)析
ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)時(shí)的留心事項(xiàng)如下：
1、正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)別離以陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照操控實(shí)驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)成果的性。有時(shí)本底較高，闡明有非特異性反應(yīng)，可選用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
2、在ELISA中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很主要的，其間包括：
（1）固相載體的選擇：ELISA試劑盒很多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其方式可所以凹孔平板、試管、珠粒等。如今常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在運(yùn)用前均可進(jìn)行選擇：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，查詢其顯色反應(yīng)是不是均一性，據(jù)此判明其吸附功用是不是出色。
（2）ELISA試劑盒包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體外表時(shí)，懇求純度要好，吸附時(shí)通常懇求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響，通常多選用4℃18～24小時(shí)。ELISA試劑盒蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進(jìn)行滴定：即用不一樣的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10μg／ml等）進(jìn)行包被后，在其它實(shí)驗(yàn)條件相一同，查詢陽(yáng)性標(biāo)本的OD值。選擇OD值z(mì)ui大而蛋白量zui少的濃度。關(guān)于大都蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)通常為1～10μg／ml。
（3）酶符號(hào)抗體作業(yè)濃度的選擇：ELISA試劑盒首先用直接ELISA法進(jìn)行開端效價(jià)的滴定（見酶符號(hào)抗體部份）。然后再固定其它條件或采用“方陣法”（包被物、待檢樣品的參看品及酶符號(hào)抗體別離為不一樣的稀釋度）在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里地滴定其作業(yè)濃度。
（4）ELISA試劑盒酶的底物及供氫體的選擇：對(duì)供氫體的選擇懇求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無(wú)色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應(yīng)留心防護(hù)。有條件者應(yīng)運(yùn)用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是如今較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應(yīng)參與強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以停止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間，以10-30分鐘為宜。底物運(yùn)用液有必要新鮮制作，尤其是H2O2在臨用前參與。