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類器官實操大本營之——固定包埋

閱讀:1157      發(fā)布時間:2023-1-13
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Q

1、類器官收集

A

收集生長至較大尺寸類器官:96孔板,生長密度較大時,使用移液槍取半孔以上,清洗1至3遍,洗去大部分基質(zhì)膠,離心沉淀,棄除大部分上清。

Q

2、瓊脂糖固定槽制備(可一次制備一批,溫密閉保存)

A

1)稱量0.2至0.4g瓊脂糖,加入至燒杯或者小試劑瓶內(nèi);

2)加入10mL左右PBS;

3)微波爐高火融化,每隔5s暫停打開,觀察,重復(fù)數(shù)次至瓊脂糖融化;

4)取約200uL融化瓊脂糖,加入至600uL EP管內(nèi);

5)在盛有瓊脂糖的小EP管內(nèi)插入一小PCR管,使瓊脂糖形成一圓尖底凹槽,室溫或者4℃冰箱靜置數(shù)分鐘,至瓊脂糖凝固,輕輕轉(zhuǎn)動小PCR管,取出PCR管,可看到瓊脂糖內(nèi)形成一個深圓尖底槽。

Q

3、類器官固定

A

1)將類器官輕輕吸出轉(zhuǎn)移至一固定槽底部;

2)輕輕加入PBS至高于瓊脂糖槽的邊緣;

3)蓋上蓋子,水平離心機1000 rpm,離心5min;

4)輕輕吸出除底部類器官沉淀外的PBS上清;

5)加入融化的瓊脂糖液體200μL;

6)室溫靜置至瓊脂糖凝固;

7)剪去固定管的底部和蓋子,置于2 mL EP管內(nèi),加入多聚甲醛至差不多裝滿整個EP管,置于4℃冰箱過夜。

Q

4、類器官包埋

A

1)脫水:取出已凝固的含有類器官沉淀的瓊脂糖塊,在梯度乙醇中脫水,70%、80%、90%、95%乙醇各1h,100%乙醇30min,待其凝固。

2)融蠟:提前4h左右打開烘箱,65℃溶蠟。

3)透明:將脫水完成后的瓊脂糖塊轉(zhuǎn)移至組織包埋盒中(二甲苯處理前需一直浸泡在無水乙醇中),將包埋盒轉(zhuǎn)移至二甲苯中5min處理兩次。

:因二甲苯有毒性,需在通風(fēng)良好區(qū)域進行操作,取出時盡量瀝盡殘留二甲苯。

4)浸蠟:透明化處理完成后立即轉(zhuǎn)入已經(jīng)融化的蠟缸中,60℃浸蠟2h后,更換新的蠟缸再次浸蠟2h。

5)包埋:包埋在冰盒上進行,將融好的純蠟倒入蠟盒三分之一處,將瓊脂塊放置于中間位置,然后再滴蠟包埋直到倒?jié)M。待蠟塊凝固后,小心脫下模具。

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