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染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)的原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。

一、細(xì)胞交聯(lián)與裂解

在裝有20ml生長培養(yǎng)基的150mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，長到80%-90%密度，約10⁷個(gè)細(xì)胞。如有必要，可進(jìn)行刺激或處理。建議采用1×10⁶個(gè)細(xì)胞作為一次ChIP的細(xì)胞量。

1）在20ml培養(yǎng)基中加入終濃度為1%的甲醛，輕輕渦旋培養(yǎng)皿混勻，使細(xì)胞在甲醛中固定，室溫固定10分鐘（對于轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔因子，可適當(dāng)延長交聯(lián)時(shí)間，但不超過30分鐘）。加入甲醛后培養(yǎng)基的顏色會發(fā)生改變；

2）在培養(yǎng)皿中加入濃度為0.125M的甘氨酸，輕輕渦旋混勻，室溫反應(yīng)5分鐘，淬滅未反應(yīng)的甲醛，終止交聯(lián)。加入甘氨酸后培養(yǎng)基的顏色會發(fā)生改變；

3）棄培養(yǎng)基，20ml預(yù)冷的1×PBS洗滌細(xì)胞，重復(fù)洗滌一次；

4）在培養(yǎng)皿中加入2ml 預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑混合物的1×PBS；使用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，4°C，800g，離心5分鐘；

5）去除上清液（此步細(xì)胞可在液氮中快速冷卻，存放于-80°C保存幾個(gè)月），細(xì)胞再次重懸于0.5ml含蛋白酶抑制劑混合物的細(xì)胞裂解緩沖液中，冰上孵育15分鐘，每5分鐘渦旋一次；

6）4°C，800g，離心5分鐘。小心去除上清液，加入0.5ml含蛋白酶抑制劑混合物的細(xì)胞核裂解緩沖液，使其重懸。

二、超聲處理片段化 DNA

超聲處理的效果取決于細(xì)胞類型、細(xì)胞濃度和儀器。需要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定超聲的最佳條件，以便將交聯(lián)DNA剪切為如上圖的約200-1000bp長度。染色質(zhì)片段化對于ChIP實(shí)驗(yàn)成功很關(guān)鍵。片段化不足會導(dǎo)致樣本丟失，片段化過度會破壞靶標(biāo)蛋白表位、降低ChIP效率。在超聲過程中，保持樣品一直處于冰上低溫狀態(tài)。不要使探頭接觸超聲管底部或管壁，如超聲過程產(chǎn)生泡沫，需暫停超聲并調(diào)整超聲管位置。

超聲處理后，4°C，12000g離心10分鐘。離心后，留取5μl染色質(zhì)溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠分析，以檢測超聲效率?？蓪⒊暻昂统暫蟾魅〉?μl染色質(zhì)溶液對比分析。

圖1 超聲前超聲后

三、靶蛋白和DNA 免疫共沉淀

將下述緩沖液放于冰上保存：低鹽洗滌緩沖液高鹽洗滌緩沖液，LiCl洗滌緩沖液和TE洗滌緩沖液。配制450μl稀釋緩沖液（含蛋白酶抑制劑混合物），冰上保存。如有多個(gè)樣品可合并配制。

1）取上述50μl離心后的裂解液上清加入到新的離心管中，作為一次免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的DNA混合物樣本。每50μl 裂解液中含有1×10⁶個(gè)細(xì)胞裂解產(chǎn)物。ChIP反應(yīng)包括陽性對照抗體管、陰性對照IgG管和目的蛋白抗體管。推薦陰性對照IgG和目的抗體使用同一物種來源。

2）在上述50μl片段化染色質(zhì)樣品的離心管中加入上述配制好的450μl稀釋緩沖液，充分混勻。每管取5μl樣品于新的離心管中作為實(shí)驗(yàn)的1% “input"，用于實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化與數(shù)據(jù)處理，保存于4°C，直至蛋白DNA復(fù)合物洗脫與解交聯(lián)步驟。

3）取完inpμt的離心管中分別加入1-10μg免疫沉淀抗體，4°C轉(zhuǎn)子上孵育4h以上或過夜。

4）每個(gè)離心管中加入20μl蛋白A/G磁珠（建議將吸頭前端剪去一小部分后再吸取磁珠），4°C轉(zhuǎn)子上孵育2h。

5）磁力架吸附，靜置1-2分鐘，去上清。按如下步驟洗滌蛋白A/G磁珠-抗體-蛋白/DNA復(fù)合物：

低鹽洗滌緩沖液，4°C轉(zhuǎn)子上孵育3-5分鐘，洗滌一次；

高鹽洗滌緩沖液，4°C轉(zhuǎn)子上孵育3-5分鐘，洗滌一次；

LiCl 洗滌緩沖液，4°C轉(zhuǎn)子上孵育3-5分鐘，洗滌一次；

注：使用前將等體積A液及B液混勻，請勿提前混勻，否則會導(dǎo)致出現(xiàn)沉淀析出。TE 緩沖液，4°C轉(zhuǎn)子上孵育3-5分鐘，洗滌一次。

圖2 靶蛋白和DNA免疫共沉淀示意圖

四、洗脫和解交聯(lián)

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：解凍蛋白酶K；ChIP洗脫緩沖液恢復(fù)至室溫，以確保SDS溶解；配制洗脫緩沖液；ChIP洗脫緩沖液100μl+蛋白酶K 1μl（多個(gè)樣本可合并配制）。

1）樣品管及Input管加入ChIP洗脫緩沖液（含蛋白酶K）；

2）62°C孵育2小時(shí)；

3）在95°C下培養(yǎng)10分鐘；

4）讓樣品冷卻至室溫；

5）10000g離心10秒收集管蓋及管壁上殘留樣品，采用磁力架分離磁珠。將上清液小心轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的試管中。

五、DNA 純化

采用純化柱進(jìn)行DNA純化（免疫沉淀和input）。

六、鑒定分析

QPCR或者高通量測序的方法檢測IP得到的DNA。

七、常見問題

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