簡介

神經(jīng)系統(tǒng)對許多化合物、環(huán)境因素和某些天然物質(zhì)的毒性作用非常敏感。在脊髓損傷、卒中或創(chuàng)傷性腦損傷等病理過程中，神經(jīng)毒性可導(dǎo)致大腦或周圍神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生損傷。它也是阿爾茨海默病和帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的一個主要因素。

使用人源誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPSCs) 進行高內(nèi)涵成像可用于檢查候選藥品或環(huán)境污染物的神經(jīng)營養(yǎng)、神經(jīng)保護或神經(jīng)毒性作用。本說明展示了使用 iPSCs 和 Molecular Devices 系統(tǒng)和軟件通過自動化終點和活細(xì)胞檢測進行神經(jīng)元毒性篩選。

優(yōu)勢

•   通過真正自動化的采集和分析進行設(shè)置且無人值守

•    即時量化每個神經(jīng)元的多個表型特征

•    監(jiān)測活細(xì)胞數(shù)分鐘或數(shù)天的實時毒性

基于iPSC 的毒性篩選

iPSC 對神經(jīng)元毒性研究非常有用，因為它們表現(xiàn)出成熟神經(jīng)元的功能和行為，并且可用數(shù)量眾多。此具有生物相關(guān)性的細(xì)胞類型與高內(nèi)涵成像和分析結(jié)合使用使得神經(jīng)毒性檢測對于篩選先導(dǎo)化合物非常有價值，并有可能降低臨床前開發(fā)成本和對動物實驗的需要。使用來自 Cellular Dynamics International 的分化人iPSC 源性iCell 神經(jīng)元開發(fā)了所展示的示例檢測。

定量神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的完整性

高內(nèi)涵分可在 96 或 384 孔板中形成神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò) 3-5 天，然后用有毒化合物進行 48-72 小時的挑戰(zhàn)。在 ImageXpress Micro 系統(tǒng)上使用針對 ß-微管蛋白的標(biāo)記抗體對神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)進行可視化。使用 MetaXpress高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件中的神經(jīng)突生長應(yīng)用模塊進行圖像分析，并使用 AcuityXpress 高內(nèi)涵信息學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。 

神經(jīng)突生長應(yīng)用模塊可發(fā)現(xiàn)有或沒有核復(fù)染的細(xì)胞體，通可在 96 或 384 孔板中形成神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò) 3-5 天，然后用有毒化合物進行 48-72 小時的挑戰(zhàn)。在 ImageXpress® Micro 系統(tǒng)上使用針對 ß-微管蛋白的標(biāo)記抗體對神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)進行可視化。使用 MetaXpress® 高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件中的神經(jīng)突生長應(yīng)用模塊進行圖像分析，并使用 AcuityXpress 高內(nèi)涵信息學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。 

神經(jīng)突生長應(yīng)用模塊可發(fā)現(xiàn)有或沒有核復(fù)染的細(xì)胞體，通過細(xì)胞體的存在確定陽性神經(jīng)元細(xì)胞，并識別從這些細(xì)胞延伸的熒光標(biāo)記的神經(jīng)突。幾個參數(shù)可表征神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，包括神經(jīng)突數(shù)量、生長長度以及每個細(xì)胞或每個視野的分支數(shù)量。然后可以計算每個孔中細(xì)胞數(shù)量和表型的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

圖 1：神經(jīng)突生長應(yīng)用模塊結(jié)果。頂部：使用神經(jīng)突生長應(yīng)用模塊產(chǎn)生的圖像分析掩膜的對照和高劑量孔。標(biāo)記為 ß -微管蛋白 III（綠色）的神經(jīng)突和細(xì)胞核（藍色）。左下角：總生長的細(xì)胞毒性化合物的劑量-反應(yīng)曲線。右下角：根據(jù)總生長曲線計算 IC50 值。 

評估線粒體膜電位

線粒體去極化已被證明是缺氧損傷或細(xì)胞毒性的早期征兆，可使用 JC-10 染料監(jiān)測線粒體膜電位（圖 2）。在健康細(xì)胞中，JC-10 以橙色 J-聚集體的形式在線粒體中蓄積。隨著內(nèi)膜電位的損失，JC-10 的單體形式被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，發(fā)出綠色熒光。

神經(jīng)元用 JC-10 染色，并暴露于抗霉素A或纈氨酸霉素30分鐘，抗霉素A或纈氨酸霉素是導(dǎo)致氧化呼吸中斷和Ca2+超載的化合物。MetaXpress軟件中的顆粒度模塊可根據(jù)高于背景的強度和顆粒對象的大小進行定制以識別線粒體。將結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為視野中的細(xì)胞計數(shù)。

監(jiān)測活細(xì)胞毒性

可使用細(xì)胞活力染料Calcein AM 和 Hoechst 細(xì)胞核染料組合對活細(xì)胞進行毒性檢測。使用 帶有能夠維持孔板溫度、CO2 和濕度水平的環(huán)控裝置的ImageXpress Micro 系統(tǒng)測試了許多已知的神經(jīng)毒性和無毒性化合物（圖 3）。觀察到的這些化合物的神經(jīng)毒性活性與體內(nèi)或臨床數(shù)據(jù)相關(guān)，從而證實了該測定法可用于預(yù)測性神經(jīng)毒理學(xué)的可能性。

由于 Calcein AM 除對活神經(jīng)元的細(xì)胞體外，還對神經(jīng)元延伸進行染色，因此使用神經(jīng)突生長應(yīng)用模塊對神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)進行分析，并且使用細(xì)胞分類應(yīng)用模塊通過 Calcein AM 染色和核大小來識別活神經(jīng)元和死神經(jīng)元。

圖 2.  經(jīng)抗霉素A處理的神經(jīng)元。頂部：對照神經(jīng)元和經(jīng)抗霉素A 處理并用 JC-10 染色的神經(jīng)元的圖像。使用 20X 物鏡采集顯示的圖像。底部：通過每個細(xì)胞的平均總線粒體/顆粒來測定劑量反應(yīng)。

圖 3.  甲基汞對神經(jīng)元的影響。頂部：顯示甲基汞對神經(jīng)元的劑量依賴性毒性作用的圖像。Calcein AM 的存在表示活細(xì)胞的代謝（綠色）。左下角：通過神經(jīng)突生長確定細(xì)胞毒性化合物的 IC50 曲線，并通過核大小評估細(xì)胞毒性。右下角：Hoechst 染色細(xì)胞核為偽彩紅色。

用于神經(jīng)元毒性篩選的完整解決方案

Molecular Devices 利用 ImageXpress Micro 系統(tǒng)、MetaXpress 軟件和 AcuityXpress 軟件為在篩選環(huán)境中評估神經(jīng)元毒性提供完整的解決方案。我們的活細(xì)胞選項與復(fù)雜的表型圖像分析相結(jié)合，可在藥物開發(fā)的早期階段識別毒性化合物。