簡(jiǎn)介

凋亡是一種重要的機(jī)制，可向胚胎發(fā)育等正常過程以及癌癥和神經(jīng)退行性疾病等疾病過程中的細(xì)胞發(fā)出程序性死亡的信號(hào)。

EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488 檢測(cè)試劑盒可通過使用 NucView 488 Caspase-3 底物檢測(cè)完整細(xì)胞群內(nèi)的凋亡。該底物由熒光 DNA 染料偶聯(lián) caspase-3/7 DEVD 識(shí)別序列組成。最初是非熒光的，它會(huì)滲透細(xì)胞膜。如果細(xì)胞是凋亡的，底物會(huì)被 caspase-3/7 裂解，釋放出進(jìn)入細(xì)胞核并與 DNA 結(jié)合的染料，從而產(chǎn)生亮綠色熒光。細(xì)胞可以活細(xì)胞成像，無需洗滌步驟即可去除死細(xì)胞或凋亡細(xì)胞，但染料在固定后也會(huì)被保留。

這種靈活的檢測(cè)可使用 ImageXpress® Micro 高內(nèi)涵成像系統(tǒng)和 MetaXpress® 分析軟件進(jìn)行，以計(jì)算孔中凋亡細(xì)胞的發(fā)生率。

材料

• EarlyTox Caspase-3/7-D NucView 488 檢測(cè)試劑盒（Explorer Kit Cat. No. R8350 or Bulk Kit Cat. No. R8351, DMSO formulation）

• CHO M1WT3 細(xì)胞

• Camptothecin喜樹堿

• 384 孔黑色透明底微孔板 （Corning Falcon）

• DRAQ5 核染色

• ImageXpress Micro 高內(nèi)涵成像系統(tǒng)

檢測(cè)方法

CHO 細(xì)胞以每孔 3，500 個(gè)細(xì)胞、每孔 50 μL 的密度接種于經(jīng) 384 孔組織培養(yǎng)處理的微孔板中。允許它們?cè)?7°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中附著并生長(zhǎng)過夜。然后，將孔用從 100 μM 至 0.1 μM 的 1：2 梯度稀釋的喜樹堿（抗癌藥物）處理 24 小時(shí)，誘導(dǎo)凋亡。

在溫暖的培養(yǎng)基中制備了 10 μM 2X NucView 488 底物工作溶液。從每個(gè)孔中小心抽吸 25 μL，并替換為 25 μL 2X 底物溶液，最終濃度為 5 μM。將細(xì)胞在 37°C 下孵育 1 小時(shí)，之后以 10 μL 的量向每個(gè)孔中加入 6X DRAQ5 核染料溶液，最終濃度為 2 μM。孵育 30 分鐘后，使用 FITC 和 Cy5 濾光片組以及 10X Plan Apo 物鏡在 ImageXpress Micro 系統(tǒng)上讀取孔板（圖 1）。在此放大倍數(shù)下，一個(gè)視野通常捕獲 1，1001，400 個(gè)細(xì)胞核，以便一個(gè)圖像產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)結(jié)果。

圖 1：NucView Caspase 3/7 染色細(xì)胞（綠色）和 DRAQ5 核染色（紅色）的圖像疊加。（頂部）經(jīng) 50 μM 喜樹堿處理的細(xì)胞表現(xiàn)出高凋亡細(xì)胞核發(fā)生率。（底部）未經(jīng)處理的對(duì)照組顯示很少有細(xì)胞核具有凋亡染色。

兼容此 Molecular Devices 系統(tǒng)

ImageXpress Micro 高內(nèi)涵
成像系統(tǒng)

數(shù)據(jù)分析

將在 ImageXpress Micro 成像系統(tǒng)上拍攝的細(xì)胞，使用細(xì)胞分類模塊在 MetaXpress 軟件中進(jìn)行分析。通過直觀的用戶輸入，該模塊可識(shí)別 DRAQ5 染色細(xì)胞核作為總細(xì)胞計(jì)數(shù)，并將Caspase 3/7 陽(yáng)性細(xì)胞核分類為凋亡細(xì)胞核?？稍u(píng)估如核大小、強(qiáng)度和凋亡百分比等多個(gè)參數(shù)。如果對(duì)化合物暴露產(chǎn)生的總毒性干擾凋亡評(píng)估，則分析中可省略細(xì)胞計(jì)數(shù)低于特定數(shù)量的孔。

結(jié)果

繪制凋亡細(xì)胞百分比與喜樹堿濃度的關(guān)系圖并應(yīng)用 4 參數(shù)曲線擬合，得到 EC5₀ 值為 5.7μM 的濃度反應(yīng)曲線（圖 2）。EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488 檢測(cè)試劑盒與 ImageXpress Micro 系統(tǒng)和 MetaXpress 軟件配合使用，可為科學(xué)家提供快速、可靠的基于圖像的細(xì)胞凋亡定量。