一站式TA克隆試劑盒（B）AT克隆就是利用T載體兩個3’端各帶有一個T突出，而PCR擴增產(chǎn)物兩個3’端各帶有一個A突出的特點，在DNA連接酶的作用下，將PCR產(chǎn)物克隆到T載體中的過程，它是克
隆PCR擴增產(chǎn)物的主要手段。本產(chǎn)品提供了完成AT克隆的所有成份，具有下列特點：
1. 一站式，用戶只需要準備PCR產(chǎn)物即可進行AT克隆。
2. T載體由Xcm I酶切方法制備，兩個5’端100%含T突出，自連率幾乎為零。
3. 克隆效率高，一次AT克隆實驗一般能得到上百個重組子。
4. 陽性率高，一般能到90%以上, 大大縮短了篩選工作。
5. 提供供兩次實驗用的對照插入片段，方便分析實驗數(shù)據(jù)。
6. 插入位點兩側(cè)有對稱的常見酶切位點（如EcoR I），便于對克隆的PCR片段進行近
一步的分析。
7. 克隆位點兩側(cè)分別有T3和T7 RNA聚合酶啟動子, 便于用克隆的PCR片段制備RNA
探針。
8. 可以使用pUC/M13 Forward和Reverse測序引物測定插入片段的序列。
9. T克隆位點位于β-半乳糖苷酶的α-肽編碼區(qū)內(nèi)，可以進行藍白斑篩選。
10.含有絲狀噬菌體f1 復制起始子，可以制備單鏈DNA。
規(guī)格及成分 成 份 編 號 20 次塑料袋包裝
即用型藍白 T 載體（50 ng/uL） 20 uL
對照插入片段（50 ng/uL） 5 uL
T4 快速連接緩沖液，2× 100 uL
T4 DNA 連接酶（5 U/uL） 30 uL
超純水 100935 1 mL
高效感受態(tài)細胞 100 uL×10 只(只 B 型有)
使用手冊 90801sc 1 份
運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。感受態(tài)細胞需要干冰運輸，-70℃保存，有效期 6 個
月。
自備試劑 插入片段
一站式TA克隆試劑盒（B）使用方法 一： PCR產(chǎn)物的純化和定量注意事項
1. 由于PCR體系中有大量會抑制DNA連接反應的dATP、還有一些可能在電泳膠上不
一定會顯示出來的非特異性擴增產(chǎn)物和引物二聚體，所以PCR產(chǎn)物必須用膠回收方
法制備才能用于本試劑盒的連接?？梢苑謩e使用本公司柱式DNABACK
（CAT#:60202）和PAGE DNAback（包括柱式PAGE DNAback）從瓊脂糖膠
和PAGE膠上純化回收PCR片段。具體操作見相關產(chǎn)品使用手冊。
2. 瓊脂糖膠回收的電泳緩沖液zui不要使用TBE緩沖液，因為它會影響DNA的膠回收
效率。
3. 為避免UV對DNA的傷害，切膠zui在日光下進行（使用天恩澤基因的綠如藍染料
的話，可以直接在黑色背景下看見DNA條帶，不需要紫外光）。如果使用EB或其
他染料，必須在紫外下切膠時，zui選擇長波(360 nm)紫外燈并以zui快速度切膠，
文獻報道短波UV（300 nm 和240 nm）會使DNA連接效率降低400多倍。使用
短波UV時，可以使用天恩澤基因的DNA防護劑UV Erasol（CAT#：60601）減少
傷害。
4. PCR片段的體積越小越便于后續(xù)操作。洗脫PCR片段時，用zui少量的洗脫液洗脫。
本試劑盒要求PCR回收片段的濃度zui為50ng/uL。如果濃度不夠，zui用醇沉
淀法沉淀后直接在管內(nèi)設置連接反應，也可以使用本公司的核酸濃縮劑（CAT#：
110801-30）直接濃縮。
5. 為準確定量回收的PCR產(chǎn)物同時又節(jié)約樣品，zui使用微量分光光度計（只需用1
uL樣品測量）。如果分光光度計需要大量樣品，建議使用電泳法定量：將回收的
PCR片段與濃度已知的DNA Marker在含EB或綠如藍染料的瓊脂糖凝膠中電泳，
通過比較DNA條帶的相對熒光強度而估測PCR產(chǎn)物的濃度。
二：連接反應
1. 短暫離心裝有藍白T載體、連接緩沖液和T4 連接酶的離心管。
2. 在三個離心管中加入下列成分（注意，對照可以不做，在出現(xiàn)問題時再做）：
成份 樣品管 陽性對照管 自連對照管
T4 快速連接緩沖液，2× 5 uL 5 uL 5 uL
藍白 T 載體（50 ng/uL）
（=0.03 pmol/uL）
1 uL 1 uL 1 uL
自備 PCR 純化產(chǎn)物
(0.03-0.1 pmol/uL) X uL（見注） 不加 不加
對照插入片段（50 ng/uL）
（=0.06 pmol/uL）
不加 1.5 uL 不加
T4 DNA 連接酶（5 U/uL） 1-1.5 uL 1-1.5 uL 1-1.5 uL
超純水 補到 10 uL 補到 10 uL 補到 10 uL
注: 如何根據(jù)T載體的用量計算PCR純化片段的*用量？
*：確定插入片段與載體的*摩爾比，在本產(chǎn)品的T載體的長度固定（3Kb）時，
*摩爾比跟插入片段的長度關系如下：
插入片段長度 與載體的摩爾比
1 Kb 以下 2：1 或 3：1
跟 T 載體接近（±1 Kb） 1 ：1
比 T 載體長 1Kb 或更多 1：2 或 1：3
第二：根據(jù)選定的*摩爾比按下面方程式計算用量
 (n g)
(k b)]
(n g) (k b) 插入片段和載體的摩爾比 插入片段的量 載體大小
加入載體的量 插和入片段大小
? ?
?
提供的T載體長度為3 Kb，推薦用量為50ng，如果PCR片段長度為0.5 Kb，
*摩爾比設定為3:1，則其用量為:
插和入片段 載體
載體 插入片段 3/1 25 ng
3.0 kb
50 ng 0.5 kb
? ?
?
3. 用移液器吹打連接反應液使之混勻，然后放置在16℃孵育30分鐘-過夜。
4. 65℃5分鐘滅活連接酶后直接用于轉(zhuǎn)化或-20℃保存。
三：細菌轉(zhuǎn)化及篩選（僅供參考，本產(chǎn)品不提供相關試劑）
1. 將100 μL轉(zhuǎn)化效率在1×108 cfu/µg以上的感受態(tài)細胞于冰上解凍。
2. 取5-10 μL連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)幾次以混勻內(nèi)容物。
3. 在冰上放置30分鐘。
4. 將離心管放42℃熱休克90秒，然后快速將其轉(zhuǎn)移到冰浴中放置1~2分鐘。
5. 每管中加900 μL LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時復蘇細胞。
6. 將100uL復蘇涂布到含Amp的LB瓊脂平板上（也可加上X-gal和IPTG）。
7. 室溫4,000 rpm離心剩余的900 uL復蘇細胞5分鐘，棄去800 μL上清，用剩余100
μL培養(yǎng)基重懸細胞并涂布到含Amp的LB瓊脂平板上（可加X-gal、IPTG）。
8. 將平板置于室溫直至液體被吸收。此步非常重要，否則培養(yǎng)板將在37℃排除水分，
細菌將隨水在培養(yǎng)基上到處游動，不能形成單個菌落。
9. 倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12~16小時后可出現(xiàn)菌落。一般情況下陽性對照組總共會
有上千個菌落（100 uL轉(zhuǎn)化液產(chǎn)生的菌落數(shù)×10），自聯(lián)對照只有少數(shù)幾個菌落，
樣品組的菌落數(shù)取決于PCR回收片段的質(zhì)量。
10. 按常規(guī)方法篩選重組子。