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技術(shù)文章

氣相-三重四極桿質(zhì)譜分析食品與飼料中二惡英

閱讀：1537 發(fā)布時(shí)間：2019-2-24

二惡英（PCDD/Fs）是包括多氯二苯并二惡英（PCDDs）和多氯二苯并呋喃（PCDFs）在內(nèi)的一類劇毒有機(jī)化合物，主要通過垃圾燃燒或作為生產(chǎn)有機(jī)氯農(nóng)藥等特定化學(xué)物質(zhì)的副產(chǎn)物而產(chǎn)生。二惡英可進(jìn)入食物鏈，并長(zhǎng)期存留從而產(chǎn)生生物累積。人類食用受污染食物是二惡英的主要暴露途徑。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署認(rèn)定即使僅暴露于背景值水平的二惡英，仍可能使人類罹患癌癥。因此，檢測(cè)并定量環(huán)境中，尤其是食品和動(dòng)物飼料中的二惡英至關(guān)重要。

歐盟立法通過氣相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用（GC-HRMS）對(duì)污染樣本中的二惡英進(jìn)行確證和定量的方法被認(rèn)為是此類檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。隨著近年來氣相-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS/MS）的不斷突破，GC-MS/MS已可實(shí)現(xiàn)兼顧高靈敏度和高選擇性。上述進(jìn)展使得GC-MS/MS成為控制食品和飼料中二惡英高含量水平的又一有力工具。4

根據(jù)即將生效的歐盟新法規(guī)中規(guī)定，除了之前法規(guī)中有關(guān)GC-HRMS方法的標(biāo)準(zhǔn)外1,3，使用GC-MS/MS技術(shù)確證二惡英時(shí)，要求儀器必須滿足下列性能指標(biāo)：4

1.每個(gè)四極桿的分辨率都不得低于單位質(zhì)量分辨率（單位質(zhì)量分辨率定義為能夠區(qū)分相差一個(gè)質(zhì)量單位的兩個(gè)質(zhì)譜峰的低分辨率）。

2.對(duì)于所有標(biāo)記或未標(biāo)記的分析物質(zhì)的檢測(cè)均需有兩個(gè)特征母離子，每個(gè)母離子對(duì)應(yīng)特定碎片子離子。

3.實(shí)測(cè)離子對(duì)相對(duì)離子強(qiáng)度與理論值偏差不得超過15%（校正標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)平均值），以此確認(rèn)串聯(lián)質(zhì)譜狀態(tài)穩(wěn)定，尤其是每個(gè)分析物質(zhì)裂解過程中的碰撞能量和碰撞氣體壓力。

【實(shí)驗(yàn)/設(shè)備條件】

表1.氣相色譜和進(jìn)樣器參數(shù)設(shè)置

依據(jù)即將生效的歐盟對(duì)二惡英檢測(cè)的指標(biāo)要求，測(cè)試中每個(gè)四極桿的分辨率均設(shè)置為單位分辨率（表2）。

表2.質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置

TSQ 8000 Evo通過采用電子電離源（EI）電離，在串聯(lián)質(zhì)譜模式下工作。數(shù)據(jù)采集過程中，根據(jù)歐盟針對(duì)二惡英GC-MS/MS檢測(cè)的指標(biāo)要求，每個(gè)化合物分別進(jìn)行兩個(gè)離子對(duì)的選擇性反應(yīng)檢（SRM）。數(shù)據(jù)通過智能定時(shí)掃描（timed-SRM）模式確保每個(gè)通道的離子流色譜峰不少于12個(gè)掃描點(diǎn)。每對(duì)離子對(duì)及其碰撞能量的優(yōu)化均由軟件中的全自動(dòng)SRM離子對(duì)優(yōu)化（AutoSRM）功能自動(dòng)優(yōu)化完成，具體結(jié)果見表3。

數(shù)據(jù)處理應(yīng)用ThermoScientific™TargetQuan 3.1軟件完成，該軟件專為日常環(huán)境中持久性有機(jī)污染物（POPs）常規(guī)定量分析而設(shè)計(jì)，可處理MS、MS/MS以及HRMS數(shù)據(jù)。

表3.天然及13C標(biāo)記的二惡英類化合物的離子反應(yīng)參數(shù)及碰撞能量

數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)通過TargetQuan軟件完成處理過程，該軟件可使用同位素稀釋法對(duì)持久性有機(jī)污染物（POPs）進(jìn)行分析。

軟件基于相對(duì)響應(yīng)因子（或平均響應(yīng)因子），結(jié)合毒性當(dāng)量因子（TEFs）自動(dòng)計(jì)算出毒性當(dāng)量（TEQs）并得出總毒性

當(dāng)量。

【樣品提取】

天然及13C標(biāo)記的二惡英類化合物均來自WellingtonLaboratories Inc.™。以下食品及飼料提取樣本由西班牙國(guó)家研究委員會(huì)（CSIC）下屬環(huán)境評(píng)估與水質(zhì)研究所提供：三份干燥魚類樣本（之前曾用于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部其他研究），一份飼料樣本（內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）及一份奶粉樣本（認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）。飼料基質(zhì)樣本的提取和凈化通過PowerPrep™固相萃取系統(tǒng)

完成，奶粉和魚樣本則通過多層硅膠、堿性氧化鋁柱以及活性炭柱依次手動(dòng)過濾完成。

【實(shí)驗(yàn)/操作方法】

本文評(píng)價(jià)了Thermo Scientific™ TSQ 8000™ Evo三重四極桿GC-MS/MS用于分析二惡英類化合物的性能表現(xiàn)。為此，實(shí)驗(yàn)中采用標(biāo)準(zhǔn)溶液及食品、飼料樣本來評(píng)估儀器性能是否符合新的二惡英測(cè)試指標(biāo)要求。同時(shí)，比較了TSQ 8000 Evo GC-MS/MS與GC-HRMS測(cè)試相同食品、飼料提取物的測(cè)試結(jié)果。

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果/結(jié)論】

Timed-SRM是一種*不同于之前“經(jīng)典”的分時(shí)間段進(jìn)行方法設(shè)置的分析手段，它使目標(biāo)化合物的數(shù)據(jù)采集設(shè)定于已知化合物色譜保留時(shí)間附近的一段特定窗口內(nèi)，而不是一個(gè)較寬的時(shí)間分段內(nèi)。這樣，每個(gè)目標(biāo)化合物在分析檢測(cè)器中的駐留變得，極大地提高了儀器靈敏度，降低了方法檢測(cè)限。此外，通過使用timed-SRMs還可分別檢測(cè)臨近出峰的同分異構(gòu)體，例如六氯代二苯并對(duì)二惡英/呋喃類化合物（HxCDD/Fs）。圖1為應(yīng)用timed-SRM與分段式SRM對(duì)靈敏度影響的比較。

圖1.與分段式SRM相比，timed-SRM模式對(duì)靈敏度提高比率（%）。以上數(shù)據(jù)通過比較每個(gè)二惡英類化合物的峰高（每秒計(jì)數(shù)）而得。

從色譜上實(shí)現(xiàn)二惡英類同分異構(gòu)體的有效分離是以123478-HxCDF與123678-HxCDF兩峰之間峰谷高度小于25%為標(biāo)準(zhǔn)的。1本實(shí)驗(yàn)中二惡英類化合物的色譜分離通過低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（EPA1613- CLS）評(píng)估。該溶液含0.1pg/µL TCDD/F、0.5 pg/µL PeCDD/F - HpCDD/F和1.0 pg/µL OCDD/F。所有天然及13C標(biāo)記的待測(cè)物均檢出，且峰形良好（圖2），所有HxCDF同分異構(gòu)體間峰谷高度均不超過5%。

圖2.低濃度天然二惡英標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜分離（括號(hào)中的濃度單位為pg/µL）。每個(gè)化合物僅展示一個(gè)SRM通道（定量離子）。

圖3.經(jīng)GC分離，123478-HxCDF與123678-HxCDF兩峰之間的峰谷高度小于5%

達(dá)到期望的檢測(cè)水平

對(duì)于二惡英檢測(cè)，重要的一點(diǎn)就是達(dá)到期望的靈敏度。作為一個(gè)確證的方法，低定量限（LOQ）應(yīng)約為高*的五分之一。1, 3, 4通常來說，考察儀器分析二惡英的靈敏度主要考慮低檢測(cè)限（LOD）和低定量限（LOQ），而對(duì)于磁質(zhì)譜，上述參數(shù)則通過信噪比（S/N）值計(jì)算（LOD信噪比值為3，LOQ信噪比值為10）。

通過GC-MS/MS的MS/MS模式采集的數(shù)據(jù)通常沒有或只有很低的噪音，因此需要重新考慮LOD和LOQ的計(jì)算方法。假如由于技術(shù)原因，無(wú)法獲得可信的信噪比值來計(jì)算上述參數(shù)，那么計(jì)算每個(gè)化合物的LOQ應(yīng)根據(jù)低濃度點(diǎn)（例如CSL）來計(jì)算，同時(shí)參考內(nèi)標(biāo)（回收率應(yīng)在60-120%之間）、離子比例豐度以及色譜峰的情況。4所以，LOQ應(yīng)通過低濃度標(biāo)樣（CSL）以及三個(gè)相應(yīng)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液的多次重復(fù)進(jìn)樣（n=10）測(cè)試來確定。

圖4.根據(jù)二惡英一系列的稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣結(jié)果計(jì)算的LOQ。數(shù)據(jù)表明，每個(gè)待測(cè)物L(fēng)OD濃度的離子比例和響應(yīng)因子均符合限定要求。

每個(gè)化合物的LOQ計(jì)算均考慮了相關(guān)自由度的t檢驗(yàn)值（99%置信），各化合物濃度以及%RSD。結(jié)果表明，二惡英類化合物的LOD在0.01-0.05 pg/µL之間，相當(dāng)于CSL的1:5和1:10的稀釋液（在此濃度水平，離子比例和響應(yīng)因子偏差均在±15%以內(nèi)；13C標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)化合物回收率在60-120%之間）（圖4）。

終實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，TSQ 8000 Evo GC-MS/MS可對(duì)二惡英實(shí)現(xiàn)亞飛克級(jí)的檢測(cè)和確證，*符合新的歐盟規(guī)定要求。3

線性響應(yīng)

二惡英的定量主要是基于同位素稀釋法和響應(yīng)因子校正來計(jì)算的。其中，所有標(biāo)準(zhǔn)樣品的響應(yīng)因子均通過外標(biāo)曲線平均而得。1, 5平均響應(yīng)因子%RSD是通過樣品測(cè)試序列開始和結(jié)尾時(shí)測(cè)試的兩條含六個(gè)測(cè)試點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算而得。所有結(jié)果%RSD在1.2-8%之間，*符合EPA關(guān)于不得大于15%的限定要求5（表4）。

表4.二惡英類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性（每條曲線六個(gè)測(cè)試點(diǎn)）。表中展示了每個(gè)天然二惡英化合物的平均響應(yīng)因子準(zhǔn)確度（%RSD）。所有數(shù)據(jù)來自測(cè)試樣本序列開始和結(jié)尾時(shí)測(cè)試的兩套標(biāo)準(zhǔn)曲線。

峰面積重現(xiàn)性

17種二惡英的峰面積精密度考察是通過對(duì)低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液（CSL）多次重復(fù)進(jìn)樣測(cè)試（n=16）進(jìn)行的。結(jié)果表明所有化合物的%RSD值均低于所規(guī)定大15%的限值，其中，偏差大的為2378-TCDD（8.3%），偏差小的為12378-PeCDD（3.2%）（圖5）。

離子比例

樣品測(cè)試過程中還測(cè)定了17種二惡英各自的離子對(duì)離子比（IR），并將測(cè)定值與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的離子比例測(cè)定值（標(biāo)準(zhǔn)樣本CSL-CS4的平均值）做比較。測(cè)試結(jié)果表明，樣本中所有待試物質(zhì)的IR與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)IR偏差均小于15%，符合歐盟對(duì)二惡英測(cè)試的規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)4（圖6）。

圖5.標(biāo)準(zhǔn)曲線低濃度點(diǎn)（濃度范圍0.1-1.0 pg/µL）重復(fù)進(jìn)樣（n=16）的峰面積重現(xiàn)性。虛線標(biāo)明大容許偏差范圍為15%。

圖6. 17種二惡英在樣本提取物中的離子比例與標(biāo)準(zhǔn)樣品（CSL-CS4）計(jì)算得出的平均離子比例值比較

樣本提取物中的二惡英定量

進(jìn)行二惡英定量測(cè)試的樣本提取物是由巴塞羅那的CSIC制備的。在實(shí)驗(yàn)色譜條件下所有作為空白對(duì)照的基質(zhì)樣本中均未發(fā)現(xiàn)明顯的基質(zhì)干擾。圖7為2378-TCDD的離子流色譜圖。

通過測(cè)試每個(gè)樣本，計(jì)算出樣本中的二惡英類化合物各單體含量（單位為WHO-PCDD/F-TEQ pg/g），并與應(yīng)用GC-HRMS測(cè)試相同樣本所獲數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。從結(jié)果來看，TSQ8000 Evo與GC-HRMS測(cè)試所得的數(shù)據(jù)結(jié)果較為一致（圖8-圖10）。

圖7. 2378-TCDD與其內(nèi)標(biāo)13C-2378-TCDD在魚（a）、飼料（b）和奶粉（c）樣本中的提取離子流色譜圖。圖中所標(biāo)的為樣本中的化合物濃度（pg/g）。

圖8.飼料樣本中各二惡英類化合物分別通過TSQ 8000 Evo和GC-HRMS測(cè)試所得含量（TEQ pg/g）比較。

圖9.奶粉樣本中各二惡英類化合物分別通過TSQ 8000 Evo和GC-HRMS測(cè)試所得含量（TEQ pg/g）比較。

圖10.魚樣本中各二惡英類化合物分別通過TSQ 8000 Evo和GC-HRMS測(cè)試所得含量（TEQ pg/g）比較。

比較TSQ 8000 Evo和磁質(zhì)譜測(cè)試數(shù)據(jù)計(jì)算出每個(gè)樣本中的總二惡英含量值，偏差不超過5%（圖11）。每種基質(zhì)樣本中的二惡英大限值（ML）和處置限值（AL）亦被標(biāo)出。2

Z-Score結(jié)果

為了檢查TSQ 8000 Evo GC-MS/MS測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)所有魚樣本進(jìn)行了Z-Score檢驗(yàn)（這些樣本曾用于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部其他測(cè)試）。通過每個(gè)樣本的公議值（例如總二惡英含量值）、測(cè)定值及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差值進(jìn)行檢驗(yàn)計(jì)算。檢驗(yàn)結(jié)果顯示，通過GC-MS/MS測(cè)試的所有魚樣本數(shù)據(jù)的Z-Score值均在±2限值以內(nèi)，平均值為-0.8（圖12）。