病理組織包埋染色俗稱HE 染色法為蘇木精-伊紅染色法，是石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一，也是組織學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)教學(xué)與科研中基礎(chǔ)、廣泛的技術(shù)方法。

　　對(duì)建立跨區(qū)耳瓣模型第3 d的鼠耳進(jìn)行全組織包埋免疫熒光染色，觀察跨區(qū)耳瓣模型建立3 d后，跨區(qū)耳瓣choke區(qū)域小血管及毛細(xì)血管的管徑大小，末梢神經(jīng)走行以及與血管再生相關(guān)的單核巨噬細(xì)胞［4］分布情況。CD31與α-SMA抗體分別對(duì)血管內(nèi)皮與血管平滑肌進(jìn)行染色，利用Tuj1及α-SMA對(duì)軸突與血管分別進(jìn)行標(biāo)志，利用CD68抗體進(jìn)行單核巨噬細(xì)胞染色。具體操作步驟如下：（1）制備封閉液（簡(jiǎn)稱10%HIGS），將10 ml山羊血清、0.2 ml曲拉通X-100溶于100 ml磷酸鹽緩沖液中,并應(yīng)用0.45 μm的濾器對(duì)配成的溶液進(jìn)行濾過。（2）在室溫條件下，將處理完的鼠耳前層皮膚放入裝有1 ml 10% HISG的24孔板中，搖床輔助孵育30 min。（3）制備一抗溶液，使用10%HIGS稀釋一抗，稀釋比例1∶500。將CD31、CD68、α-SMA、Tuj1一抗同時(shí)稀釋混合使用，孵育時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)可加入0.2%抑菌防腐。（4）將經(jīng)孵育的皮膚取出放入新孔或用滴管吸除10%HIGS溶液后，加入150 μm一抗溶液，4 ℃搖床孵育過夜，第2天將皮膚轉(zhuǎn)移至新孔洞或用滴管吸除原有溶液，加入1 ml 2%HIGS溶液，室溫下?lián)u床洗脫一抗3次，每次15 min，每次洗脫更換液體。（5）制備二抗溶液，使用10%HIGS稀釋二抗，稀釋比例1∶500，將CD31、CD68、α-SMA、Tuj1二抗同時(shí)稀釋混合使用，通過0.22 μm的生物濾膜對(duì)配成的液體進(jìn)行過濾。13 000 g離心二抗溶液，離心5 min。（6）將洗脫后的皮膚取出，放入新孔洞或用滴管吸除原有溶液，加入150 μm二抗溶液，室溫下?lián)u床孵育1 h，避光。（7）取出皮膚，將皮膚轉(zhuǎn)移至新孔洞，加入1 ml 2%HIGS溶液。室溫下，搖床洗脫二抗3次，每次15 min，每次洗脫更換液體。（8）取出皮膚，轉(zhuǎn)移至新孔洞，加入150 μm DAPI (1∶1000) 溶液染色，孵育10 min。（9）取出皮膚，轉(zhuǎn)移至新孔洞，加入1 ml 2%HIGS溶液。室溫下，搖床洗脫3次，每次15 min，每次洗脫更換液體。（10）把組織樣本放入載玻片上鋪平，滴加1滴熒光封片劑，封蓋蓋玻片,放于室溫過夜，待熒光封片劑凝固，于共聚焦激光顯微鏡下掃描觀察。

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