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副溶血性弧菌(VP)熒光PCR試劑盒說明書

閱讀:224        發(fā)布時間:2024-11-27
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    上海晅科生物科技有限公司

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【產(chǎn)品名稱】

 商品名稱:副溶血性弧菌(VP)核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)

Name:Diagnostic Kit for Vibrio parahaemolyticus DNA(Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于檢測水樣糞便,疑似污染的水、食物等樣本中的副溶血性弧菌,用于副溶血性弧菌感染   的輔助診斷,其檢測結(jié)果僅供參考。

【檢驗原理】

本試劑盒用一對副溶血性弧菌特異性引物,結(jié)合一條特異性探針,用熒光 PCR 技術(shù)對副溶血性弧菌的

DNA 進行體外擴增檢測,用于科研實驗中對可疑感染病料的病原學檢測。

【試劑組成】

包裝規(guī)格50T/盒

VP 反應(yīng)液500μL×2 管

酶液50μL×1 管

VP 陽性質(zhì)控品250μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管

說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、運輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次,有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

水樣便取 0.5~1mL;疑似污染的食物取 1g

【保存和運輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h;若需長期保存,應(yīng)放置-70℃以下保存,凍融不超過 3 次。

【使用方法】

1.樣品處理(樣本處理區(qū))

1.1樣本前處理

水樣便 13000rpm 離心 2min,去盡上清;疑似污染的食物用手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.05g 于研磨器中研磨, 加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中,8000rpm 離心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中;疑似污染的水直接取 100μL

1.2核酸提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑(離心柱法)進行核酸提取,請按照試劑說    明書進行操作。

2.試劑配制(試劑準備區(qū))

根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照;反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份,多配制 1 份),每測試反應(yīng)體系配制如下表:

試劑VP 反應(yīng)液酶液

用量(樣本數(shù)為 N)19μL1μL

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,20μL/管。

3.加樣(樣本處理區(qū))

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻, 短暫離心。

4.PCR 擴增(核酸擴增區(qū))

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi);

4.2設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL;

熒光通道選擇: 檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光,選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號

11 cycle95℃2min

245 cycles95℃15sec

60℃30sec

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定(請參照各儀器使用說明書進行設(shè)置,以分析 ABI7500 儀器為例)

反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值(用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整,Start 值可設(shè)在 3~15、End 值可設(shè)在 5~20,使閾值線位于擴增曲線指數(shù)期,陰性質(zhì)控品的擴增曲線平直或低于閾值線),點擊 Analyze 自動獲得分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽性:檢測通道 Ct 值≤40,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線; 陰性:樣本檢測結(jié)果無 Ct 值,且無特異性擴增曲線;

可疑:樣本檢測結(jié)果 40<Ct 值≤45,建議重復(fù)檢測,如果檢測通道仍為 40<Ct 值≤45,且曲線有明顯的增長曲線,判定為陽性,否則為陰性。

5.3質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品:Ct 值>38 或無 Ct 值;

陽性質(zhì)控品:擴增曲線有明顯指數(shù)生長期,且 Ct 值≤32; 以上條件應(yīng)同時滿足,否則實驗視為無效。

6.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān);

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現(xiàn)假陽性結(jié)果;

3.陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏,會導(dǎo)致假陽性結(jié)果;

4.病原體在流行過程中基因突變、重組,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

5.不同的提取方法存在提取效率差異,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

6.試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果;

7.本檢測結(jié)果僅供參考,如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴格按照說明書進行;

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,完-全混勻并短暫離心;

3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存;

4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行,以免交叉污染;

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;

8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。

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