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高光譜受激拉曼散射顯微術(shù)對(duì)植物組織進(jìn)行高光譜化學(xué)成像
受激拉曼散射（SRS）顯微術(shù)利用基于分子振動(dòng)特征的化學(xué)特異性，可實(shí)現(xiàn)無(wú)標(biāo)記生物成像。超光譜SRS成像可以獲得每個(gè)像素的分子振動(dòng)光譜，不僅能夠研究各種生物分子的光譜差異，還可根據(jù)它們的光譜差異區(qū)分出不同成分。然而由于光譜差異的細(xì)wexing，以前的無(wú)標(biāo)記SRS成像可辨別的成分的數(shù)量只有4個(gè)。日本研究人員Takanori Iino等使用高光譜SRS對(duì)植物組織進(jìn)行了成像，包括山茶（Camellia japonica）葉子、擬南芥（Arabidopsis thaliana）根和苔類(lèi)植物（Marchantia polymorpha L）的葉狀體。表明SRS可以在沒(méi)有標(biāo)記的情況下區(qū)分苔類(lèi)植物中多達(dá)6種成分。結(jié)果證明超光譜SRS成像可用于無(wú)標(biāo)記多色成像分析植物組織中的各種生物分子。文章以“Multicolour chemical imaging of plant tissues with hyperspectral stimulatedRaman scattering microscopy"為題發(fā)表于ROC Analyst。
背景
觀察各種生物分子的分布對(duì)理解生命系統(tǒng)的機(jī)制很重要。受激拉曼散射（Stimulated Raman scattering, SRS）顯微技術(shù)可實(shí)時(shí)獲取分子振動(dòng)圖像并得到廣泛應(yīng)用，如無(wú)標(biāo)記成像各種細(xì)胞和組織中的生物分子、代謝成像、超多路成像。近期開(kāi)發(fā)出的幾種超光譜SRS成像方法可以獲得每個(gè)像素的分子振動(dòng)光譜，以區(qū)分出不同化學(xué)成分，實(shí)現(xiàn)多色無(wú)標(biāo)記成像。
但高光譜SRS顯微術(shù)辨別不同分子的能力還有待充分開(kāi)發(fā)?？紤]到典型生物分子的光譜寬度（約10cm-1）與碳-氫（C-H）拉伸區(qū)寬度（約200cm-1）之比，原則上高光譜SRS可以根據(jù)分子振動(dòng)光譜的差異區(qū)分多達(dá)10種以上成分。而事實(shí)上在C-H拉伸區(qū)高光譜SRS成像可以區(qū)分的成分?jǐn)?shù)量通常為3-4個(gè)，因?yàn)榈湫偷纳锓肿釉贑-H拉伸區(qū)往往具有相似的光譜。高光譜SRS圖像的光譜相量分析不僅可以利用光譜特征差異，還可利用強(qiáng)度差異在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)五種成分分類(lèi)，但這種分類(lèi)缺乏形態(tài)學(xué)細(xì)節(jié)。有報(bào)道在指紋區(qū)對(duì)植物組織進(jìn)行拉曼成像應(yīng)用，指紋區(qū)光譜特征比C-H拉伸區(qū)更豐富，最終多元分解出6種成分。然而拉曼成像受到各種背景信號(hào)的影響，可能會(huì)影響分解結(jié)果，因此不同的分解算法間似乎仍然難以獲得一致的結(jié)果。
本研究在C-H拉伸區(qū)使用超光譜SRS顯微技術(shù)，證明能夠?qū)ν暾参锝M織進(jìn)行無(wú)標(biāo)記多色成像。具體而言，對(duì)山茶葉（Camellia japonica）進(jìn)行三色成像，對(duì)擬南芥（Arabidopsis thaliana）葉、初生根頂端和中部進(jìn)行四色成像，對(duì)苔類(lèi)植物（Marchantia polymorpha L.）葉狀體進(jìn)行六色成像。預(yù)期在植物組織中生物分子組成研究方面，超光譜SRS顯微術(shù)能夠成為一種有效的無(wú)標(biāo)記成像分析工具。
圖1 自制SRS顯微鏡示意圖。使用（i）雙色同步皮秒泵浦脈沖和波長(zhǎng)可調(diào)的斯托克斯脈沖；（ii）由共振振鏡掃描儀和普通振鏡掃描儀組成的X-Y掃描儀；（iii）物鏡將泵浦和斯托克斯脈沖聚焦到樣品上（下）并收集通過(guò)樣品傳輸?shù)拿}沖（上）；（iv）提取泵浦脈沖的濾光器，泵浦脈沖由硅檢測(cè)器檢測(cè)，硅檢測(cè)器連接到自制的鎖定放大器以獲取SRS信號(hào)。
結(jié)果
首先獲得山茶（Camellia japonica）葉子的SRS成像。圖2a為葉子的數(shù)據(jù)集舉例。從測(cè)量的超光譜SRS數(shù)據(jù)中手動(dòng)提取光譜基（圖2b）。根據(jù)光譜形狀和形態(tài)推測(cè)，2940cm-1處顯示峰（CH3拉伸模式）的是細(xì)胞壁（黃線）、2850-2930cm-1處顯示平坦響應(yīng)（烷基鏈）的是飽和脂肪酸（品紅線）、源于約3200cm-1處羥基拉伸模式的低波數(shù)尾部的是水（黑線）。各成分的圖像如圖2c所示。合成的多色圖像如圖2d所示，其中品紅色和黃色部位的形態(tài)與角質(zhì)層蠟質(zhì)層和細(xì)胞壁的形態(tài)一致。另外這些成分的重疊分布（雙向箭頭所示的黃褐色部位）證實(shí)了細(xì)胞壁-角質(zhì)層連續(xù)體的存在，其作用是調(diào)節(jié)分子運(yùn)輸進(jìn)出植物體，影響對(duì)不同病原體感染的反應(yīng)。
圖2 山茶花一片葉子的SRS成像。（a）葉片橫截面積的SRS圖像數(shù)據(jù)集示意，由91幅光譜圖像組成。為清晰起見(jiàn)對(duì)圖像進(jìn)行了裁剪。（b）用作光譜基的振動(dòng)光譜。（c）每種成分的圖像。（d）多色圖像。比例尺10 μm。雙向箭頭表示細(xì)胞壁-角質(zhì)層連續(xù)體。
圖3為擬南芥（Arabidopsis thaliana）的SRS圖像，擬南芥是植物分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究中的典型模式物種。具體來(lái)說(shuō)，對(duì)蓮座葉和初生根的中部和頂端進(jìn)行了高光譜SRS成像。所有擬南芥樣本中，都能將SRS數(shù)據(jù)集分解成四個(gè)組成部分。在蓮座葉（圖3a）中，推測(cè)提取的光譜分別是細(xì)胞壁（紅線）、由于雙光子吸收而表現(xiàn)出寬光譜響應(yīng)的色素（綠線）、在2850和2880cm-1處表現(xiàn)出尖銳峰的蠟酯（藍(lán)線），和水（黑線）。分解組分的空間分布與細(xì)胞形態(tài)一致。
在初生根的中部（圖3b）鑒別出四個(gè)光譜，推測(cè)為次生細(xì)胞壁（紅線）、在2930cm-1處顯示峰值，在2910cm-1處信號(hào)比木質(zhì)素小的蛋白質(zhì)（綠線）、在2850至2930cm-1處顯示平坦響應(yīng)（烷基鏈）的飽和脂肪酸（藍(lán)線）、水（黑線）。同樣，分解成分的空間分布與導(dǎo)管中次生細(xì)胞壁、胞質(zhì)溶膠和木栓質(zhì)層的形態(tài)一致，其中木栓質(zhì)層似乎存在于內(nèi)皮層細(xì)胞的表面，這意味著可以觀察到凱氏帶（Casparian strip），一種細(xì)胞壁材料的帶，類(lèi)似沉積在內(nèi)皮層徑向和橫向壁中的栓蛋白。
在初生根的頂端（圖3c），推測(cè)光譜是細(xì)胞壁（紅線）、蛋白質(zhì)（綠線）、在2910cm-1處有峰的多糖（藍(lán)線）、和水（黑線）。分解成分的空間分布與細(xì)胞壁、胞質(zhì)溶膠和積累淀粉的淀粉質(zhì)體的形態(tài)一致。由此使用SRS顯微術(shù)可以無(wú)標(biāo)記的方式獲得四色圖像。
圖3 擬南芥葉片和初生根的SRS成像。（a）蓮座葉。（b）初生根的中部。（c）初生根的jianduan。（i）、（ii）和（iii）分別為用作光譜基的提取光譜、每種成分的圖像和合并的SRS圖像。（a）-（c）中的（iii）合并圖像顯示了各種結(jié)構(gòu)，如（a）中細(xì)胞壁（紅色）、葉綠素（綠色）和角質(zhì)層（藍(lán)色）；（b）中次級(jí)細(xì)胞壁（紅色）、胞質(zhì)溶膠（綠色）和存在于內(nèi)皮層細(xì)胞表面的片層上的木栓質(zhì)層（藍(lán)色）；（c）中細(xì)胞壁（紅色）、胞質(zhì)溶膠（綠色）和淀粉體（藍(lán)色）。
圖4為地錢(qián)（Marchantia polymorpha L.）葉狀體的SRS圖像，提取了六個(gè)光譜（圖4a）用作光譜基。推測(cè)提取的光譜為：范圍2850-2930cm-1寬光譜（烷基鏈），在3010cm-1處具有尖峰（C-C雙鍵相關(guān)的C-H拉伸模式）的不飽和脂肪酸（紅線）、色素（綠線）、油體中包含的次級(jí)代謝物（可能是萜類(lèi)化合物和芳香成分的高度多樣混合物）（藍(lán)線），其在2910cm-1（CH2反對(duì)稱(chēng)拉伸模式）和3050cm-1（芳香C-H拉伸模式）顯示出強(qiáng)峰、飽和脂肪酸（品紅線）、細(xì)胞壁（黃線）和水（黑線）。圖4b顯示了分解成分的空間分布，與脂滴、葉綠體、油體、角質(zhì)層蠟層和細(xì)胞壁的形態(tài)一致。圖4c為葉狀體的合并SRS圖像，展示了通過(guò)超光譜SRS成像獲得的無(wú)標(biāo)記六色成像圖。
圖4 地錢(qián)（Marchantia polymorpha L.）葉狀體的SRS成像。（a）提取光譜用作光譜基。（b）每種成分的圖像。（c）合并的SRS圖像，顯示不同結(jié)構(gòu)：脂滴（紅色）、葉綠素（綠色）、油體（藍(lán)色）、角質(zhì)層（洋紅色）、細(xì)胞壁（黃色）。（d）地錢(qián)全株的照片。
結(jié)論
本文利用高光譜SRS成像展示了各種類(lèi)型植物組織的多色無(wú)標(biāo)記成像，實(shí)現(xiàn)了通過(guò)線性解混方法區(qū)分微小的光譜差異。鑒于葉綠體、細(xì)胞壁和液泡等細(xì)胞器中積累的色素的自發(fā)熒光通常會(huì)妨礙熒光成像，高光譜SRS成像將特別適用于植物組織復(fù)雜結(jié)構(gòu)的成像分析。
但該方法一個(gè)重要的技術(shù)挑戰(zhàn)是高光譜SRS數(shù)據(jù)集中成分的自動(dòng)分類(lèi)。本研究的光譜基是通過(guò)研究許多像素的光譜來(lái)手動(dòng)提取的，既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，而且一旦它們反映的不是純成分，則偽矩陣反演給出的圖像也是成分的混合體。此外如果一些譜基不是線性獨(dú)立的，偽矩陣反演會(huì)產(chǎn)生噪聲圖像，這可表明組分的數(shù)量。目前還沒(méi)有成功量化光譜分析的準(zhǔn)確性。雖然已有各種自動(dòng)提取光譜基或分類(lèi)不同細(xì)胞成分的算法，但使用這些算法提取多達(dá)六個(gè)成分似乎仍然較為困難，仍需要開(kāi)發(fā)新的分類(lèi)方法。
總之本文證明了超光譜SRS顯微術(shù)可用于植物組織的無(wú)標(biāo)記多色成像，利用其分子識(shí)別能力，可對(duì)多達(dá)六種成分進(jìn)行無(wú)標(biāo)記多色成像。隨著光譜提取方法的發(fā)展，超光譜SRS顯微術(shù)的能力將得到進(jìn)一步發(fā)展，成為植物組織無(wú)標(biāo)簽多色成像分析的有力工具。
參考文獻(xiàn)：Iino, T. , et al. "Multicolour chemical imaging of plant tissues with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy." Analyst.