黃曲霉毒素(Total Aflatoxins)M1免疫親和柱操作說明書

【概要】

黃曲霉毒素（Aflatoxin）是黃曲霉、寄生曲霉等真菌產生的次級代謝產物，被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機構劃分為1類致癌物，同時又是一種毒性*的劇毒物質，廣泛存在于各種食物中。玉米，花生，大米，小麥等谷物及其副產品是黃曲霉毒素的主要來源，同時飼料中的黃曲霉毒素B1經過動物代謝后產生的黃曲霉毒素M1仍然具有很強的毒性和致癌性，也廣泛存在牛奶，血液，組織等食品中。黃曲霉毒素作為肝癌的三大誘因之一，也是胃癌，腸癌等疾病的主要原因，對人類的健康構成很大威脅。世界各國對食品，飼料中的黃曲霉毒素都有嚴格的*。2010年6月1日開始施行的乳品安全國家標準中對乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的檢測進行了規(guī)定，主要使用的樣品前處理方法就是免疫親和柱凈化法。

【適用范圍及性能】

   本公司真菌毒素免疫柱系列產品測試形式是一個高性能的免疫親和柱，設計用于在進行 HPLC（高效液相色譜法）、GC-MS（氣相色譜-質譜聯(lián) 用 儀）、ELISA（酶聯(lián)免疫吸附劑測定）之前清理（凈化）或 濃縮樣本。

   用于定性、定量檢測牛奶，奶粉，發(fā)酵乳，干酪，奶油等樣品中黃曲霉毒素M1的以及樣品前處理。

柱容量：≥100ng

回收率：≥90%

【試驗原理】

本產品的測定的基礎是抗原抗體反應，黃曲霉毒素M1單克隆抗體連接在柱內凝膠上，樣品中的黃曲霉毒素M1經過提取、過濾、稀釋，然后將樣品提取液緩慢的通過黃曲霉毒素M1免疫親和層析柱，在免疫親和柱內，毒素與抗體結合，之后洗滌免疫親和柱除去沒有被結合的其他物質。用甲醇洗脫黃曲霉毒素M1，然后注入到分析儀器中用于檢測。

【包裝組成】

黃曲霉毒素M1標準品（選配）

25支/盒，3mL柱管/支

產品說明書1份

【需要而未提供的設備及試劑】

設備：

┅┅高速均質器或組織勻漿機

┅┅粉碎機

┅┅200mL/50mL量筒

┅┅天平：感量0.1g

┅┅酸度計

┅┅分液漏斗

┅┅微量移液器：單道 100mL～1000mL

┅┅槽紋濾紙（折疊快速定性或定量濾紙）

┅┅50mL漏斗

┅┅旋轉蒸發(fā)儀

┅┅一次性玻璃試管

┅┅泵流操作架（包括空氣泵，不同容積的玻璃注射器等）

┅┅燒杯，容量瓶，錐形瓶等

試劑：

┅┅甲醇（色譜級）

┅┅乙腈（色譜級）

┅┅石油醚

┅┅蒸餾水或去離子水

┅┅氫氧化鈉溶液（0.5mol/L）稱取2g氫氧化鈉溶解于100mL水中

【樣本處理步驟】

（一）牛奶

┅┅將100mL牛奶水浴加熱至40 oC；

┅┅4000r/min離心15min，收集50mL清澈液待用

（二）乳粉和粉狀嬰幼兒配方食品

┅┅稱取10g奶粉樣品，將100mL50 oC水多次少量加入，攪拌，使奶粉充分溶解

┅┅6000r/min離心15min，收集50mL清澈液待用

（三）發(fā)酵乳(包括固體狀、半固體狀和帶果肉型)

┅┅稱取60 g混勻的試樣，用0.5 mol/L 的氫氧化鈉溶液在酸度計指示下調pH至7.4；

┅┅用高速均質器在 9500 轉/分鐘下告訴勻漿5 min

┅┅水浴加熱至40 oC；

┅┅4000r/min離心15min，收集50mL清澈液待用

（四）干酪

┅┅稱取經切細、過10目圓孔篩混勻的試樣5g置于50 mL離心管中，加2 mL水和30 mL甲醇；

┅┅用高速均質器在 9500r/分鐘下告訴勻漿5 min；

┅┅超聲提取30 min；

┅┅在6000r/分鐘下離心15 min，收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。

┅┅在分液漏斗中加入30 mL石油醚（4.3），振搖2 min；

┅┅待分層后，將下層移于50 mL燒杯中，棄去石油醚層。

┅┅重復用石油醚提取2次；。

┅┅將下層溶液移到100 mL圓底燒瓶中，減壓濃縮至約2 mL；┅┅濃縮液倒入離心管中，燒瓶用乙腈-水溶液(1+4) 5 mL分2次洗滌，洗滌液一并倒入50 mL離心管中；

┅┅加水稀釋至約50 mL，在6000 轉/分鐘下離心 5 min，上清液供凈化處理。

（五）奶油

┅┅稱取5g試樣，置于50 mL燒杯中；

┅┅用20 mL石油醚將其溶解并移于250mL具塞錐形瓶中。

┅┅加20 mL水和30 mL甲醇，振蕩30 min后，將全部液體移于分液漏斗中；

┅┅待分層后，將下層溶液全部移到100 mL圓底燒瓶中，在旋轉蒸發(fā)儀中減壓濃縮至約5 mL，加水稀釋至約50mL，供凈化處理。

【親和柱凈化步驟】

┅┅將免疫親和柱連接于50.0mL玻璃注射器下。準確移取50.0mL清澈液注入玻璃注射器；

┅┅將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節(jié)壓力使溶液以約2-3mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體；

┅┅更換10ml玻璃注射器與親和柱連接，在注射器中加入10ml水，調節(jié)壓力使水以約6mL/min流速清洗親和柱。

┅┅準確加入4mL色譜級乙腈洗脫，流速為1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。

【結果判定】

經免疫親和柱凈化后，收集到的乙腈洗脫液可直接使用熒光計或者HPLC檢測，也可使用薄層色譜或者酶聯(lián)免疫試劑盒進行檢測。收集到的4ml洗脫液中的黃曲霉毒素含量相當于50ml牛奶樣品、發(fā)酵乳樣品或者5g奶粉樣品、干酪樣品和奶油樣品中黃曲霉毒素M1的含量。

如果HPLC檢測需要其它溶劑，可以將乙腈洗脫液氮氣吹干，然后復溶

【注意事項】

┅┅黃曲霉毒素危害極大，應戴手套操作。

┅┅使用過的玻璃容器及黃曲霉毒素溶液最好用5%濃度的次氯酸鈉溶液浸泡過夜。

┅┅不要使用過了有效日期的免疫親和柱。

【貯藏條件及保存期】

貯藏條件：親和柱2-8℃保存，不可凍存。

保存期：該產品有效期為12個月。