熒光共聚焦顯微鏡是在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上，配以激光掃描裝置，通過可見光激發(fā)熒光探針，然后通過計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)獲得細(xì)胞的圖像。不僅可以觀察固定的細(xì)胞和組織切片，還可以實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察和檢測(cè)活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、分子和離子。
如何對(duì)熒光共聚焦顯微鏡進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察？
1、細(xì)胞內(nèi)鈣變化的實(shí)時(shí)定量測(cè)定。
2、測(cè)量細(xì)胞內(nèi)pH值的變化。
激光共聚焦顯微鏡是測(cè)量多種離子濃度并顯示其分布的有效工具。聚焦信息的有效識(shí)別使得在亞細(xì)胞水平顯示離子分布成為可能。熒光探針可用于測(cè)量單個(gè)細(xì)胞中的PH值以及活細(xì)胞中各種離子(Ca+、K+、Na+、Mg2+)的濃度和變化。一般來(lái)說(shuō)，電生理記錄裝置和攝像技術(shù)可以快速檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)離子量的變化，激光共聚焦技術(shù)可以提供更好的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中Ca+濃度動(dòng)態(tài)變化的圖像，對(duì)研究Ca+的細(xì)胞內(nèi)動(dòng)力學(xué)有意義。
3、檢測(cè)膜電位的變化。
單體在低電位時(shí)存在，發(fā)出綠色熒光，聚集體在高電位時(shí)發(fā)出紅色熒光。隨著電位的增加，紅色熒光也增加。
4、檢測(cè)細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生。
5、藥物篩選
藥物、病毒、細(xì)菌等的熒光標(biāo)記。當(dāng)檢測(cè)到藥物跨膜進(jìn)入組織或細(xì)胞時(shí)，可以檢測(cè)到藥物是否進(jìn)入，其位置含量和動(dòng)態(tài)過程。
6、細(xì)胞對(duì)細(xì)胞通信的研究
激光共聚焦顯微鏡可以通過觀察縫隙連接分子在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移來(lái)測(cè)量一些傳遞細(xì)胞調(diào)控信息的離子和小分子。該技術(shù)可用于研究胚胎發(fā)育、生殖發(fā)育、神經(jīng)生物學(xué)、腫瘤發(fā)生等過程中縫隙連接通訊的基本機(jī)制和功能，也可用于識(shí)別對(duì)縫隙連接有潛在毒性的化學(xué)物質(zhì)。
7、觀察細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)。
熒光共聚焦顯微鏡大大提高了光子產(chǎn)生效率，樣品可以與毒性較小的染料結(jié)合，以減少每次掃描時(shí)激光束對(duì)細(xì)胞的損傷。LSCM可用于數(shù)小時(shí)的長(zhǎng)期定時(shí)掃描，以記錄細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)等細(xì)胞生物學(xué)現(xiàn)象。
8、熒光漂白恢復(fù)的檢測(cè)
當(dāng)一個(gè)細(xì)胞中的熒光分子被激光漂白或淬滅而失去發(fā)光能力時(shí)，相鄰細(xì)胞中未淬滅的熒光分子可以通過細(xì)胞間的縫隙擴(kuò)散到漂白的細(xì)胞中，從而恢復(fù)熒光。該技術(shù)可用于分析細(xì)胞生物學(xué)過程，如細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞膜上的受體流動(dòng)和大分子組裝。
