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廣州市艾貝泰生物科技有限公司

B型流感疫苗株生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝優(yōu)化

時(shí)間:2024-7-17 閱讀:226
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 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院與山西農(nóng)業(yè)大學(xué)等多個(gè)團(tuán)隊(duì)通力合作,在病毒學(xué)報(bào)在線發(fā)表題為B型流感疫苗候選株在MDCK 懸浮細(xì)胞上培養(yǎng)工藝優(yōu)化研究,通過選株rIBV 在MDCKs細(xì)胞上的生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝進(jìn)行了優(yōu)化,獲得一株具有高感染力和高病毒滴度的MDCKs 細(xì)胞源疫苗候選株rIBV,為下游流感疫苗生產(chǎn)及純化工藝奠定了基礎(chǔ)。
 
  季節(jié)性流感是由在世界各地流行的流感病毒引起的急性呼吸道感染性疾病。目前在人類中流行的主要有B型流感病毒等病毒,預(yù)防接種疫苗仍然是我國當(dāng)今應(yīng)對流感暴發(fā)的有效措施。MDCKs細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)則不需要添加血清,相較于雞胚培養(yǎng),Vero細(xì)胞培養(yǎng)具有更好的穩(wěn)定性和安全性,同時(shí)借助生物反應(yīng)器能夠提供大量同步分裂、增殖快的細(xì)胞,更能夠保證疫苗質(zhì)量,是當(dāng)前疫苗生產(chǎn)的主流工藝。
 
  為了大規(guī)模生產(chǎn)重組B型流感疫苗候選株rIBV,研究探索了rIBV在無血清MDCKs細(xì)胞上的最佳培養(yǎng)條件,再擴(kuò)大到生物反應(yīng)器中優(yōu)化工藝參數(shù),經(jīng)過連續(xù)傳代15代后測定了MDCKs細(xì)胞源毒種rIBV的遺傳穩(wěn)定性和病毒滴度。通過對病毒培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,確定了rIBV在MDCKs細(xì)胞上增殖的最佳培養(yǎng)條件是TOI為72h、MOI=0.001、CCI為4.0×10^6細(xì)胞、TPCK胰酶濃度為2μg/mL、50%DO和pH=7.2±0.5。rIBV在MDCKs細(xì)胞上連續(xù)傳代15代后仍然具有高度遺傳穩(wěn)定性。相比于雞胚源rIBV株,適應(yīng)MDCKs細(xì)胞生長15代后rIBV株的EID50由106.25/mL提高至109.5/mL,TCID50由104.5/mL提高至108.25/mL。
 
MDCKs細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)
 
  MDCKs細(xì)胞經(jīng)搖瓶逐級擴(kuò)大培養(yǎng)后,取生長良好的細(xì)胞以初始密度為1.5×10^6細(xì)胞接種到調(diào)試好的5L生物反應(yīng)器,采用攪拌式培養(yǎng),有效培養(yǎng)體積為3L,傳代密度參照搖瓶中優(yōu)化確定的培養(yǎng)條件,其他關(guān)鍵參數(shù):溫度為(37±0.1)℃,pH值7.2±0.3,DO值50%,攪拌轉(zhuǎn)速100r/min,連續(xù)培養(yǎng)120h,每12h取細(xì)胞培養(yǎng)樣監(jiān)測細(xì)胞密度及細(xì)胞活率,做三次重復(fù);期間每隔24h取樣,按照試劑盒說明書步驟處理樣品,測得葡萄糖、乳酸和谷氨酸含量,并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),每次做三個(gè)重復(fù)。
 
最佳DO的篩選
 
  MDCKs細(xì)胞經(jīng)搖瓶逐級擴(kuò)大培養(yǎng)后,取生長良好的細(xì)胞以初始密度為1.5×10^6細(xì)胞接種到調(diào)試好的5L生物反應(yīng)器,采用攪拌式,有效培養(yǎng)體積為3L,相關(guān)參數(shù)參照搖瓶中優(yōu)化確定的培養(yǎng)條件,關(guān)鍵參數(shù):溫度為(33±0.1)℃,pH值7.2±0.05,DO設(shè)30%、50%、70%三個(gè)對照,攪拌轉(zhuǎn)速120r/min,每24h取細(xì)胞培養(yǎng)樣測HA效價(jià),每次做三個(gè)重復(fù)。
 
  MDCKs細(xì)胞接種到5L生物反應(yīng)器中,設(shè)置關(guān)鍵參數(shù):溫度為(33±0.1)℃,pH值7.2±0.05,攪拌轉(zhuǎn)速120r/min,確定最佳DO,實(shí)50%DO作為后續(xù)反應(yīng)器培養(yǎng)的設(shè)置條件。
 
最佳pH的篩選
 
  MDCKs細(xì)胞經(jīng)搖瓶逐級擴(kuò)大培養(yǎng)后,取生長良好的細(xì)胞以初始密度為1.5×10^6細(xì)胞接種到調(diào)試好的5L生物反應(yīng)器,采用攪拌式,有效培養(yǎng)體積為3L,相關(guān)參數(shù)參照搖瓶中優(yōu)化確定的培養(yǎng)條件,關(guān)鍵參數(shù):溫度為(33±0.1)℃,DO值按照優(yōu)化好的值設(shè)定,pH值為6.8、7.0、7.2、7.4設(shè)四個(gè)對照,死區(qū)設(shè)為0.05,攪拌轉(zhuǎn)速120r/min,每24h取細(xì)胞培養(yǎng)樣測HA效價(jià),每次做三個(gè)重復(fù)。
 
  MDCKs細(xì)胞接種到5L生物反應(yīng)器中,設(shè)置關(guān)鍵參數(shù):溫度為(33±0.1)℃,DO值50%,攪拌轉(zhuǎn)速120r/min,確定最佳DO。我們選擇pH值為7.2為生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件,死區(qū)設(shè)置為0.05。

 

 
結(jié)果
 
  B型重組嵌合病毒rIBV在MDCKs細(xì)胞上連續(xù)傳15代后獲得一株高滴度且遺傳穩(wěn)定的MDCKs細(xì)胞基質(zhì)疫苗株。我們對傳代過程中病毒的生長特性及遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了研究,rIBV按照生物反應(yīng)器優(yōu)化條件,篩選出一株既遺傳穩(wěn)定又具有高滴度的疫苗株rIBV,病毒滴度的增高也證明了MDCKs細(xì)胞其作為疫苗生產(chǎn)基質(zhì)更具有價(jià)值。

 

 

 
  綜上所述,本研究優(yōu)化了rIBV在MDCKs細(xì)胞上的增殖條件,并成功放大到5L生物反應(yīng)器,經(jīng)過連續(xù)傳代獲得一株高感染力和病毒滴度的MDCKs細(xì)胞基質(zhì)rIBV疫苗株,為后續(xù)高質(zhì)量疫苗的大批量生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
 
  生物反應(yīng)器培養(yǎng)可獲得更高的收益率,生物反應(yīng)器的控制系統(tǒng)可以完成更多工作,可監(jiān)測和控制的參數(shù)數(shù)量基于生物反應(yīng)器中的傳感器和控制元件數(shù)量,可以更好的進(jìn)行培養(yǎng)工藝條件的篩選,優(yōu)化。工藝簡單、操作靈活,有良好的適用性;培養(yǎng)工藝容易放大,可為生物體生長和增殖提供均質(zhì)的環(huán)境;產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定,非常適合工業(yè)化生產(chǎn);管路布置較為簡單,能提供較好的無菌條件,細(xì)胞生長過程中不易污染。
 
  艾貝泰深耕生物制藥領(lǐng)域,憑借在生物反應(yīng)器行業(yè)近20年的經(jīng)驗(yàn)沉淀,致力于打造自主生物反應(yīng)器,公司擁有超150人研發(fā)團(tuán)隊(duì),歷經(jīng)數(shù)年打磨,現(xiàn)鄭重推出AbioBundle系列玻璃罐體生物反應(yīng)器。AbioBundle M/E/P/D系列玻璃罐體生物反應(yīng)器,基于對用戶需求的深刻理解,厚積薄發(fā),匠心打造,青出于藍(lán),不同凡響。我們相信越比較越專業(yè),艾貝泰自主生物反應(yīng)器將為您的工藝開發(fā)提供強(qiáng)大助力!


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