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產(chǎn)品名稱：abclonal愛博泰克HRP偶聯(lián)山羊抗兔IgG(H+L)(AS014)現(xiàn)貨供應(yīng)

產(chǎn)品貨號(hào)：AS014

產(chǎn)品品牌：abclonal愛博泰克

實(shí)驗(yàn)流程：

蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)步驟：

1、樣品制備

（1）細(xì)胞收集

a. 貼壁培養(yǎng)細(xì)胞收集

用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞或用胰酶消化處理后，400×g，離心5 min，棄上清；用適量冰PBS溶液將離心后細(xì)胞沉淀重懸，4℃，400×g 離心5min,棄上清，重復(fù)清洗步驟一次收集細(xì)胞沉淀。

b. 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞收集

收集懸浮細(xì)胞，400×g離心5min，棄上清，適量冰PBS溶液將離心后細(xì)胞沉淀重懸，4℃，400×g 離心5min,棄上清，重復(fù)清洗步驟一次，收集細(xì)胞沉淀。

c. 組織樣本收集

把組織在預(yù)冷的表面上剪切成細(xì)小碎塊，然后用液氮或超低溫冰箱中冷凍組織30min以上，迅速加液氮研磨，研磨過(guò)程盡量控制在1~2min之內(nèi)，以減少蛋白的降解。

（2）總蛋白提取

a. 細(xì)胞/組織裂解：

根據(jù)收集的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞種類添加適量的裂解液。

例如常規(guī)細(xì)胞沉淀可按照1mL裂解液/107個(gè)細(xì)胞的比例加入相應(yīng)體積的裂解液，加入裂解液后將沉淀吹打混勻。使用細(xì)胞破碎儀超聲樣本，每次超聲時(shí)間4-5s,間隔時(shí)間在5s左右，肉眼觀察，樣本為均一，不粘稠液體即可?；虿捎谜鹗幜呀夥绞竭M(jìn)行，每隔5min將離心管置于渦旋振蕩儀上震蕩10s，裂解20min。

組織碎片可按照0.5mL 裂解液/100mg組織向勻漿器中加入蛋白裂解液，每3min研磨一次，重復(fù)5次，使組織盡量碾碎（裂解液中根據(jù)需要添加或不添加蛋白酶抑制劑）。所有理解過(guò)程，務(wù)必在低溫條件下進(jìn)行。

b. 離心：

把裂解好的樣品配平后，將裂解好的樣本置于預(yù)冷的高速冷凍離心機(jī)中，13000×g離心10min，收集上清

c. 蛋白變性：

吸取少量蛋白提取液做蛋白濃度測(cè)定。向剩余的蛋白提取液的離心管中加入對(duì)應(yīng)體積的5× Loading Buffer（最終工作液為1×)，待干式恒溫器溫度升至95℃后，將1.5mL離心管插入加熱孔中，95℃加熱變性10min，待液體冷卻后置于-20℃保存。

（3）蛋白濃度測(cè)定（BCA法）

a. BCA工作液的配置

根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加入1體積BCA試劑B（50:1）配置適量BCA工作液，充分混勻。BCA工作液室溫24h內(nèi)穩(wěn)定。

b. BSA標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋

取10μl蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（5 mg/mL BSA）稀釋至50μl，使終濃度為1mg/ml。稀釋后的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品可以-20℃長(zhǎng)期保存。此標(biāo)準(zhǔn)品溶液的稀釋液可使用去離子水或1×PBS。將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入到96孔板中，加稀釋液補(bǔ)足到20μl。

c. 樣本濃度測(cè)定

加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中，如果樣本不足20μl，需加稀釋液補(bǔ)足到20μl。每孔加入 200μl BCA工作液，37℃放置20-30min。用酶標(biāo)儀測(cè)定樣本和標(biāo)準(zhǔn)品在562nm下的吸光度，或在540-595nm之間波長(zhǎng)下的吸光度。根據(jù)BSA蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線和使用的樣品體積計(jì)算出樣品的蛋白濃度。

2、凝膠電泳

（1）制膠器安裝

根據(jù)使用說(shuō)明書安裝。

（2）凝膠配置

根據(jù)目標(biāo)蛋白大小，選擇不同合適濃度的分離膠（見附表）。注意該過(guò)程注意不能有氣泡產(chǎn)生。

（3）上樣

待膠凝固好后，用移液器吸取樣品垂直梳孔上樣，建議總蛋白上樣量25ug/孔。注意內(nèi)槽Tris-Glycine SDS Running Buffer需注滿，外槽Tris-Glycine SDS Running Buffer沒過(guò)底部3~5cm即可。

（4）電泳

上樣完成后，連通電泳儀電源，注意正負(fù)極需連接正確，設(shè)定適宜的電泳參數(shù)。建議濃縮膠電泳參數(shù)為恒壓80V，分離膠采用恒壓120V。當(dāng)溴酚藍(lán)電泳到凝膠底部時(shí)，停止電泳，關(guān)閉電泳儀電源。

3、轉(zhuǎn)膜

（1）準(zhǔn)備工作

a. 轉(zhuǎn)膜緩沖液可提前2h （即開始電泳后）放入-20℃冰箱預(yù)冷。

b. 根據(jù)膠的面積大小，將濾紙以及NC膜剪裁至合適尺寸。

c. 建議目的蛋白大于20KD可選擇0.45μm NC膜；目的蛋白小于20KD可選擇0.2μm的NC膜或0.22μm的PVDF膜。選擇完畢后將膜放在Western Transfer Buffer中浸泡備用。注意使用PVDF膜需先放入甲醇中浸泡1min左右至均勻浸透，沒有白點(diǎn)即可放入Western Transfer Buffer中浸泡備用。

（2）轉(zhuǎn)膜

根據(jù)目的蛋白大小，選擇合適的轉(zhuǎn)膜條件（見附表）。

4、封閉

轉(zhuǎn)膜完成后，將膜取出，放入合適的抗體孵育槽中，加入Western Blocking Buffer 室溫孵育1h，加入TBST Buffer洗滌3次，每次5 min。

5、抗體孵育

根據(jù)所使用的一抗種類，選擇進(jìn)行下述其中1項(xiàng)的具體步驟

（1）對(duì)于無(wú)偶聯(lián)的一抗

a. 將一抗用Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按照抗體說(shuō)明書推薦比例進(jìn)行稀釋,室溫孵育1.5h或4℃過(guò)夜孵育。

b. TBST Buffer洗滌4次，每次5 min。

c. 按一抗來(lái)源選取合適的HRP偶聯(lián)二抗，按照合適比例進(jìn)行稀釋，室溫孵育1h。

d. TBST Buffer洗滌4次，每次5 min。

e. 繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)曝光操作。

（2）對(duì)于偶聯(lián)有HRP的一抗

a. 將一抗用Western Antibody Dilution Buffer(RK05743)按照抗體說(shuō)明書推薦比例進(jìn)行稀釋,室溫孵育1.5h或4℃過(guò)夜孵育。

b. 用TBST Buffer洗滌4次，每次5 min。

c. 繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)曝光操作。

6、曝光

a. 吸取等體積ECL SolutionⅠ和SolutionⅡ混勻，配制成發(fā)光檢測(cè)工作液。推薦用量為每10cm2的膜使用1-2 mL發(fā)光檢測(cè)工作液即可。

b. 用鑷子將膜取出，膜的下緣輕輕接觸吸水紙，去除膜上多余的液體。用移液槍吸取工作液并均勻覆蓋轉(zhuǎn)印膜，室溫孵育 1-2 minutes，此步驟可在潔凈保鮮膜上或塑料盒中完成。

c. 獲取WB結(jié)果：

1) 傳統(tǒng)壓片曝光顯影：將膜固定于片夾內(nèi)。暗室內(nèi)壓片1分鐘，立即顯影定影，根據(jù)結(jié)果再調(diào)整壓片時(shí)間獲取最佳信噪比圖片?；蛑苯臃謩e壓片 30 秒、1、3、5分鐘，然后一起顯影定影觀察結(jié)果。

2) 化學(xué)發(fā)光成像儀獲取電子圖片：將膜放置到成像儀內(nèi)，參考儀器說(shuō)明書設(shè)置合適的參數(shù)以獲取優(yōu)化圖片。同時(shí)應(yīng)根據(jù)靶蛋白的生物學(xué)性質(zhì)如豐度等來(lái)調(diào)節(jié)成像參數(shù)。

相關(guān)文獻(xiàn)：

[1] Brown-fat-mediated tumour suppression by cold-altered global metabolism - PMC;

[2] Mouse totipotent stem cells captured and maintained through spliceosomal repression.

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