產(chǎn)品名稱：碧云天beyotime免疫沉淀試劑盒(Protein A+G磁珠法)(P2179S)現(xiàn)貨供應(yīng)
產(chǎn)品貨號：P2179S
產(chǎn)品品牌：碧云天beyotime
使用方法：
1.試劑盒的準備。
a.參考下表，按照每個樣品使用100-500μl裂解液的比例，準備相關(guān)試劑。
Steps | Solution required | Volume per assay | Volume per assay |
Cell lysis and sample preparation | Lysis Buffer with Protease Inhibitor Cocktail | 100μl | 500μl |
Preparation of magnetic beads | TBS | ~0.5ml | ~1.5ml |
Immunoprecipitation | Magnetic Beads | 4μl | 20μl |
Wash for beads-Ab complex (3 times) | TBS | 100μl each time | 500μl each time |
Wash for beads-Ab-Ag complex (3 times) | Lysis Buffer with Protease Inhibitor Cocktail | 100μl each time | 500μl each time |
Acid elution and neutralization (optional) | Acid Elution Buffer | 20μl | 100μl |
Neutralization Buffer | 2μl | 10μl | |
SDS‐PAGE sample loading buffer elution (optional) | SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X) | 20μl | 100μl |
b.含抑制劑裂解液的配制。參考上表，按照每50-100萬細胞使用100-200μl含抑制劑裂解液用于裂解以及300-600μl含抑制劑裂解液用于洗滌的比例，配制適量的含抑制劑裂解液。將Lysis Buffer與Protease Inhibitor Cocktail (100X)按照100:1的比例混合，例如在1ml的Lysis Buffer中加入10μl Protease Inhibitor Cocktail (100X)，即得1ml含抑制劑裂解液(Lysis Buffer with Protease Inhibitor Cocktail)。配制好的含抑制劑裂解液宜放置在冰浴或4℃。
注1：如果免疫沉淀的目的蛋白涉及磷酸化修飾或者乙?；揎棧枰砑恿姿崦敢种苿┗蛉ヒ阴；敢种苿?。推薦使用碧云天的磷酸酶抑制劑混合物A (50X) (P1081/P1082)和去乙酰化酶抑制劑混合物(100X) (P1112/P1113)。如果有特殊需求，可考慮選擇其它適當(dāng)?shù)囊种苿┗旌衔?/span>。
注2：本試劑盒提供的Lysis Buffer不僅用于樣品裂解，也用于后續(xù)的洗滌步驟，請?zhí)貏e注意“注意事項"中的相關(guān)描述。
注3：含抑制劑裂解液宜現(xiàn)用現(xiàn)配，不宜配制后凍存并留作后續(xù)使用。如果有特殊需求，可以嘗試碧云天的其它多種蛋白酶、磷酸酶和去乙?；敢种苿┗旌衔?/span>。
c.TBS的配制。將TBS (10X)用超純水水稀釋至1X，即為TBS。例如1ml TBS (10X)加入9ml超純水，混勻后即為TBS。
d.磁珠的準備。由于磁珠儲存在特殊保護液中，所以需要在加入樣品前適當(dāng)洗滌。
(a)用移液器輕輕吹打重懸磁珠，按照每500μl樣品使用20μl磁珠懸濁液比例，取適量磁珠至一潔凈離心管中(FTUB015)，加入TBS至最終體積為約0.5ml。說明：如果初始磁珠體積大于0.2ml，可以考慮先直接置于磁力架上分離10秒，去除上清，然后再加入TBS至最終體積為約0.5ml。
(b)用移液器輕輕吹打重懸磁珠。置于磁力架上分離10秒，去除上清。重復(fù)上述步驟兩次。
(c)按照初始體積的量，用TBS重懸磁珠。
e.SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)的配制。取適量SDS-PAGE Sample Loading Buffer (5X)用水稀釋5倍即為SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)。例如0.2ml SDS-PAGE Sample Loading Buffer (5X)加入0.8ml超純水，混勻后即為SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)。
2.細胞或組織樣品的裂解和準備。樣品裂解后宜立即進行后續(xù)的免疫沉淀或免疫共沉淀，如果不能立即進行后續(xù)的實驗，可以-20℃或-80℃凍存，但凍融可能會影響蛋白與蛋白的相互作用。所有的樣品裂解步驟宜在冰浴或4℃操作，以盡量減少蛋白降解的可能性。樣品準備好后，注意取一定量作為Input或Total，以用于后續(xù)的Western等檢測。
a.懸浮細胞的樣品裂解和準備。250-1000×g室溫離心5min收集細胞。如有必要，可以使用PBS洗滌一次，然后吸凈殘留的液體。輕輕vortex或者彈擊管底以把細胞盡量分散開。按照每50-100萬細胞加入100-200μl的比例加入含抑制劑裂解液。輕彈管底或適當(dāng)吹打，以充分裂解細胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多，建議分裝成50-100萬細胞/管，然后再裂解。大團的細胞較難裂解充分，而少量的細胞由于裂解液容易和細胞充分接觸，相對比較容易裂解充分。充分裂解后，10,000-14,000×g在4℃離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的免疫沉淀和免疫共沉淀等。注：裂解后會出現(xiàn)少量不溶性物質(zhì)，主要為基因組DNA等，離心后會產(chǎn)生沉淀物。
b.貼壁細胞樣品的裂解和準備。吸除培養(yǎng)液。如有必要，用PBS洗滌一次，然后吸凈殘留的液體。按照每50-100萬細胞(相當(dāng)于6孔板的一個孔)加入100-200μl的含抑制劑裂解液，適當(dāng)吹打，使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸動物細胞1-2秒后，細胞就會被裂解。植物細胞宜在冰上裂解2-10min。充分裂解后，10,000-14,000×g在4℃離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的免疫沉淀和免疫共沉淀等。注：裂解后會出現(xiàn)少量不溶性物質(zhì)，主要為基因組DNA等，離心后會產(chǎn)生沉淀物。
c.細菌或酵母樣品的裂解和準備。對于1ml菌液或酵母液，離心去上清，如果有必要，可以使用PBS洗滌一次，然后吸凈殘留的液體。輕輕vortex或者彈擊管底以
把細菌或酵母盡量分散開。加入100-200μl含抑制劑裂解液，輕輕vortex或者彈擊管底以混勻，冰上裂解2-10min。如果希望獲得更好的裂解效果，細菌和酵母可以分別使用溶菌酶(lysozyme)和破壁酶(lyticase)消化，然后再使用含抑制劑裂解液進行裂解。充分裂解后，10,000-14,000×g在4℃離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的免疫沉淀和免疫共沉淀等。注：裂解后很可能會出現(xiàn)少量不溶性物質(zhì)，主要為基因組DNA等，離心后會產(chǎn)生沉淀物。
d.組織樣品的裂解和準備。
(a)把組織剪切成細小的碎片。如果組織樣品本身非常細小，也可以不再進行剪切。
(b)按照每10-20毫克組織使用100-200μl的比例加入含抑制劑裂解液。如果裂解不充分可以使用更多的含抑制劑裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。
(c)用玻璃勻漿器勻漿，或使用碧云天生產(chǎn)的E6600 TissueMaster™手持式組織研磨儀研磨，直至充分裂解。也可以把組織樣品冷凍后液氮研磨，研磨充分后加入裂解與洗滌液進行裂解。
(d)充分裂解后，10,000-14,000×g在4℃離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的免疫沉淀和免疫共沉淀等。每20mg凍存的小鼠肝臟組織用200μl含抑制劑裂解液裂解后獲得的上清，其蛋白濃度約為15-25mg/ml，不同狀態(tài)的不同組織有所不同。注：裂解后很可能會出現(xiàn)少量不溶性物質(zhì)，主要為基因組DNA等，離心后會產(chǎn)生沉淀物。
3.抗體與Protein A+G磁珠的結(jié)合。
a.抗體的準備。按抗體使用說明中推薦的稀釋比例用TBS稀釋抗體，配制成抗體工作液；或?qū)⒖贵w配制成終濃度5-50μg/ml的抗體工作液。置于冰上備用。可選做：使用抗體種屬相同的正常IgG配制相同稀釋比或終濃度的正常IgG工作液，以用于去除非特異性結(jié)合或作為陰性對照。所謂種屬相同的正常IgG是指，例如后續(xù)免疫沉淀時用的抗體是小鼠IgG，則在本步驟中可以用TBS稀釋適量的Normal Mouse IgG等以用于降低背景或作為陰性對照。
b.抗體吸附。將步驟1d準備好的Protein A+G磁珠進行磁性分離，吸除上清，加入500μl抗體工作液或正常IgG工作液，重懸后在室溫翻轉(zhuǎn)混合儀上翻轉(zhuǎn)孵育15分鐘-1小時。注：也可以直接在步驟1d的Protein A+G磁珠中加入適量抗體或正常IgG進行孵育。
c.洗滌。加入500μl的TBS，用移液器輕輕吹打重懸Protein A+G磁珠。置于磁力架上分離10秒，去除上清。重復(fù)洗滌三次。按照初始體積的量，用TBS重懸Protein A+G磁珠。注：孵育和洗滌過程中，如果磁珠發(fā)生聚團或呈片狀屬正?，F(xiàn)象，不會影響實驗結(jié)果。
4.免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)。
a.去除非特異性結(jié)合(可選做)。步驟3中準備的結(jié)合了正常IgG的Protein A+G磁珠與樣品4℃孵育1小時后磁性分離，上清樣品用于后續(xù)實驗。本實驗步驟的目的是去除與正常IgG產(chǎn)生非特異性結(jié)合的蛋白。
b.樣品與結(jié)合了抗體或正常IgG的Protein A+G磁珠孵育。按照每500μl蛋白樣品加入20μl磁珠懸濁液的比例加入結(jié)合了抗體或正常IgG的Protein A+G磁珠，置于側(cè)擺搖床或旋轉(zhuǎn)混合儀上，室溫孵育2小時或4℃孵育過夜。
注1：孵育過程中，如果磁珠發(fā)生聚團或呈片狀屬正?，F(xiàn)象，不會影響實驗結(jié)果。
注2：也可先將適量抗體或正常IgG與樣品室溫孵育1-2小時或4℃孵育過夜后，再加入10-20μl磁珠懸濁液室溫孵育1小時。具體見常見問題2。
c.磁分離。孵育完畢后，置于磁力架上分離10秒，去除上清。注：可保留部分上清液，用于檢測免疫沉淀的效果。
d.洗滌。加入0.5ml的含抑制劑裂解液，用移液器輕輕吹打重懸磁珠。置于磁力架上分離10秒，去除上清。重復(fù)使用含抑制劑裂解液洗滌三次。注：也可以通過檢測洗滌得到的液體的OD280來判斷是否洗滌完成，若OD280大于0.05，應(yīng)適當(dāng)增加洗滌次數(shù)。
5.洗脫。根據(jù)標簽蛋白的特點及后續(xù)實驗要求，可以選擇如下3種方法之一進行洗脫。
a.酸性洗脫法。本方法為非變性法，比較快速高效。洗脫后的蛋白很多情況下能保持原有的生物活性，便于后續(xù)分析檢測。
(a)每20μl原始磁珠體積，加入100μl Acid Elution Buffer (酸性洗脫液)，混勻后置于側(cè)擺搖床或旋轉(zhuǎn)混合儀上，室溫孵育5分鐘。注：孵育時間不宜超過15分鐘。
(b)孵育完畢后，置于磁力架上分離10秒，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，并立刻加入10μl Neutralization Buffer (中和液)，適當(dāng)混勻。注：須立刻加入中和液并混勻，否則長時間處于酸性洗脫液中會容易導(dǎo)致一些蛋白失去活性。
(c)為了獲得最大的洗脫效率，可重復(fù)步驟(a)和(b)，并將相同樣品合并。
(d)洗脫并中和的Flag標簽蛋白及其復(fù)合物置于4℃待用，或者-20℃或-80℃長期保存。
相關(guān)文獻：
[1] Yujuan Zhan, Qiugu Chen, Yue Song, Xianli Wei, Tingxiu Zhao, Bonan Chen, Chengxi Li, Wenbo Zhang, Yanjun Jiang, Yuhui Tan, Biaoyan Du, Jianyong Xiao, Kun Wang.Berbamine Hydrochloride inhibits lysosomal acidification by activating Nox2 to potentiate chemotherapy-induced apoptosis via the ROS-MAPK pathway in human lung carcinoma cells
Cell Biol Toxicol. 2023 Aug;39(4):1297-1317. doi: 10.1007/s10565-022-09756-8. (IF 6.284)
[2] Linhong Liao, Hui Cheng, Shusong Liu.Non-SMC condensin I complex subunit H promotes the malignant progression and cisplatin resistance of breast cancer MCF-7 cells Oncol Lett. 2022 Jul 19;24(3):317. doi: 10.3892/ol.2022.13438. (IF 2.311)
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