目錄:北京蘭博利德商貿(mào)有限公司>>分子生物學(xué)試劑>>反轉(zhuǎn)錄相關(guān)>> M-MuLV Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 貨號 | M5124 |
|---|
M-MuLV Reverse Transcriptase
產(chǎn)品貨號：M2000
儲存條件：-20℃
濃度：200 units/μl
組成 | M2000 |
M-MuLV Reverse Transcriptase(200U/μl) | 20萬U |
制品說明
本制品使用通過基因重組技術(shù)克隆表達(dá)的點(diǎn)突變型 RNase H 活性缺失的 M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶 TRUEscript Hˉ RTase。野生型的 M-MuLV 包含的 RNase H 活性能夠催化降解 DNA/RNA 雜合體中的 RNA， 因 此 在 cDNA First-Strand 的合成反應(yīng)中可能會降解 RNA/DNA 雜合體中的模板 RNA。本酶 M-MuLV(RNase Hˉ)的 RNase H 活性缺失，與 M-MuLV 相比，具有更強(qiáng)的延伸能力和穩(wěn)定性，可用于較長的 cDNA 合成以及高比例的全 長 cDNA 文庫的構(gòu)建等。
適用范圍：First-Strand cDNA 合成?？捎糜诘涂截惢?/span>的檢測。
特點(diǎn)：合成 cDNA 片段長度可達(dá) 12 kb。
First-Strand cDNA 合成(以 20 μl 反應(yīng)體系為例)
1、加入
Components | Volume |
Total RNA/mRNA | 50 ng-5 μg/5-500 ng |
Oligo(dT)18(0.5 μg /μl)or | 1 μl |
Random Primer(0.1 μg/μl) or | 1 μl |
GSP(Gene Specific Primer) | 2 pmol |
dNTP Mixture (10 mM each) | 1 μl |
5× RT Buffer | 4 μl |
RNase Inhibitor(40 units/μl) | 0.5 μl |
TRUEscript Hˉ RTase | 0.8-1μl (見注意事項 4) |
RNase free H2O to final volume | 20 μl |
2、輕輕混勻
如用 Oligo(dT)18 或基因特異引物(GSP)，42℃孵育 30-50min。
如用 Random Primer，25℃孵育 10 min，42℃孵育 30-50 min。
3、65℃加熱 15 min(或者 85℃加熱 5 min)失活 TRUEscript Hˉ RTase。
RT-PCR
建議取 1/10-1/5 體積(2-4 μl)的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為 PCR 模板。
建議 PCR 條件(以 50 μl 反應(yīng)體系為例)
Components | Volume | Final Concentration |
cDNA Template | 2 μl | as required |
Forward Primer (10 μM) | 1 μl | 0.2 μM each |
Reverse Primer (10 μM) | 1 μl | 0.2 μM each |
10×Taq Buffer (含 Mg2+) | 5 μl | 1× |
2.5 mM dNTPs | 4 μl | 0.2 mM |
Taq DNA Polymerase | 0.5 μl | 2.5 units |
ddH2O to final volume | 50 μl | Not applicable |
PCR 循環(huán)
注意事項
1.避免 RNase 污染。
2.為保證反轉(zhuǎn)錄成功建議使用高質(zhì)量的 RNA 樣品。
3.如果 RNA 模板 GC 含量豐富或者有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)，可以先只加 RNA 模板、引物和和 RNase free H2O 混勻， 65℃變性 5 分鐘，冰上冷卻，短暫離心后加入其它成分繼續(xù)下面的反轉(zhuǎn)錄步驟。
4.TRUEscript Hˉ RTase 非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸頭外導(dǎo)致?lián)p失，用前請點(diǎn)甩離心后使用，并且避免吸頭外壁沾附損失?？梢悦看伟凑?0.8μl使用，也不影響使用效果。
5.為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。
6、本品僅用于實(shí)驗研究。
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