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Western及IP細(xì)胞裂解液(弱）

產(chǎn)品貨號：W0013

儲存條件：-20℃

產(chǎn)品描述

Western及IP細(xì)胞裂解液(Cell lysis buffer for Western and IP)，是一種在非變性條件下裂解細(xì)胞或組織樣品從而制備蛋白樣品的裂解液。本裂解液裂解的細(xì)胞或組織樣品，可以用于PAGE，Western，免疫沉淀(immunol precipitation，IP)、免疫共沉淀(co-IP)和ELISA等。

本產(chǎn)品可以用于動物、植物的細(xì)胞或組織樣品，也可以用于真菌或細(xì)菌樣品。

使用說明：

1.對于培養(yǎng)細(xì)胞樣品：

a.融解Western及IP細(xì)胞裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM，或者根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加入適當(dāng)?shù)纳鲜龅鞍酌噶姿崦敢种苿┗旌衔铩?/span>

b.對于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗)。按照6孔板每孔加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液接觸動物細(xì)胞1-2秒后，細(xì)胞就會被裂解。植物細(xì)胞宜在冰上裂解2-10min。

對于懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，輕輕vortex或者彈擊管底以把細(xì)胞盡量分散開。按照6孔板每孔細(xì)胞加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。輕彈管底以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多，必需分裝成50-100萬細(xì)胞/管，然后再裂解。大團(tuán)的細(xì)胞較難裂解充分，而少量的細(xì)胞由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸，相對比較容易裂解充分。

對于細(xì)菌或酵母：對于1ml菌液或酵母液，離心去上清，如果有必要可以使用PBS洗滌一次，充分去除液體后，輕輕vortex或者彈擊管底以把細(xì)菌或酵母盡量彈散。加入100-200微升裂解液，輕輕vortex或者彈擊管底以混勻，冰上裂解2-10min。如果希望獲得更好的裂解效果，細(xì)菌和酵母可以分別使用溶菌mei和破壁酶(Lyticase)消化，然后再使用本裂解液進(jìn)行裂解。

裂解液用量說明：

通常6孔板每孔細(xì)胞或者1ml的菌液或酵母液中的細(xì)菌和酵母量加入100微升裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到150微升或200微升。每100萬動物細(xì)胞用100微升本產(chǎn)品裂解后獲得的上清，其蛋白濃度約為2-4mg/ml，不同細(xì)胞有所不同。

c.充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

2.對于組織樣品：

a.把組zhi剪切成細(xì)小的碎片。

b.融解Western及IP細(xì)胞裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM，或者根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加入適當(dāng)?shù)纳鲜龅鞍酌噶姿崦敢种苿┗旌衔铩?/span>

c.按照每20毫克組織加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。)

d.用玻璃勻漿器勻漿，或使用碧云天生產(chǎn)的E6600 TissueMaster™手持式組織研磨儀研磨，直至充分裂解。也可以把組織樣品冷凍后液氮研磨，研磨充分后加入裂解液進(jìn)行裂解。

e.充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。每20mg凍存的小鼠肝臟組織用200微升本裂解液裂解后獲得的上清，其蛋白濃度約為15-25mg/ml，不同狀態(tài)的不同組織有所不同。

f.如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過強(qiáng)烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不必使用勻漿器或研磨設(shè)備，缺點(diǎn)是不如勻漿或研磨那樣裂解比較充分。

注：

對于某些特殊蛋白的IP，如果發(fā)現(xiàn)Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)效果不是非常理想，可以嘗試用RIPA裂解液(強(qiáng)、中或弱)或NP-40裂解液。如果發(fā)現(xiàn)IP的時(shí)候背景很高，即非特異的蛋白也被IP下來，則需要選用裂解強(qiáng)度較高的裂解液，例如RIPA裂解液(強(qiáng)或中)。如果發(fā)現(xiàn)目的蛋白無法被IP下來，則說明裂解液的強(qiáng)度過強(qiáng)，可以使用較為溫和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。