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貨號(hào)：CB0231

存儲(chǔ)條件：-20oC保存，一年有效。Protein A+G Agarose Beads 4oC保存（不可-20℃凍存）。

產(chǎn)品組分

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

本免疫沉淀試劑盒適合用于無(wú)標(biāo)簽蛋白、內(nèi)源性蛋白等的下拉富集實(shí)驗(yàn)。試劑盒包含實(shí)驗(yàn)所需各種緩沖液，Protein A/G agarose beads 配合客戶(hù)自配的特異性抗體便捷快速的完成免疫沉淀或者免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)過(guò)程。本試劑盒適用于植物樣品的免疫沉淀過(guò)程，試劑盒中的緩沖液配方經(jīng)過(guò)優(yōu)化可以充分裂解植物樣本，有利于蛋白的釋放和后續(xù)IP/Coip實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。試劑盒提供的Normal Rabbit/mouse IgG可作為陰性對(duì)照排除beads的非特異性結(jié)合，如IP一抗為其他來(lái)源則需選擇與之來(lái)源相同的IgG作為對(duì)照。本試劑盒可借助磁力架完成免疫沉淀實(shí)驗(yàn)（推薦），亦可用離心的方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

使用說(shuō)明：

1. 蛋白提取

1.1取適量植物組織樣本（葉片等）0.5g-1g放置于冷凍液氮中冷凍，將冷凍后得植物組織樣本放于研缽研磨成粉末，盡可能充分研磨破壞其細(xì)胞壁。將粉末置于15ml/50ml離心管后加入1-2ml 植物裂解緩沖液（需按照1:100的比例添加C0101 Protease Inhibitor Cocktail (100X)）進(jìn)行裂解，可在4℃旋轉(zhuǎn)混勻儀15min 使裂解液和樣品充分混勻；

1.2為提高裂解效率，可加入 200ul 玻璃粉按照600-800g離心力充分震蕩 30min（添加玻璃粉的步驟為可選方案），裂解完成后 16000g，離心 30min，吸取上清置于新的離心管中，棄去沉淀。

1.3 檢測(cè)蛋白提物中的蛋白濃度。并留存一部分樣本作為Input對(duì)照用。

2免疫沉淀/共沉淀實(shí)驗(yàn)

2.1 瓊脂糖珠清洗

瓊脂糖珠存儲(chǔ)在保護(hù)液中，使用前需要充分清洗。重懸混勻protein A/G瓊脂糖珠后取適量混懸液（如總體積100ul，beads含量為25ul，吸取beads時(shí)建議用剪刀減去槍尖部分），添加漂洗緩沖液或植物裂解緩沖液至500ul

輕輕混懸吹打protein A/G瓊脂糖珠，6000g 4℃離心30s，小心去除上清，不要吸到凝膠。重復(fù)以上步驟2-3次。

2.2 protein A/G 瓊脂糖與抗體結(jié)合

（1）抗體稀釋?zhuān)喊凑湛贵w說(shuō)明書(shū)的建議稀釋抗體至工作濃度，或者配成終濃度為5-50ug/ml的抗體工作液，置于冰上備用。

（2）陰性對(duì)照設(shè)置：稀釋試劑盒中帶的與抗體來(lái)源相同的IgG，如一抗來(lái)源為Rabbit，則選Normal Rabbit IgG，稀釋為與上一步抗體同樣的濃度作為正常IgG工作液，用于陰性對(duì)照或者降低背景；

（3）抗體吸附：將2.1 步驟清洗完的protein A/G瓊脂糖珠6000g 4℃離心30s，并吸除上清，加入100ul抗體工作液或IgG 工作液（目的抗體和IgG吸附可各做一組），重懸后室溫在翻轉(zhuǎn)混合儀上孵育15min-1h。

（4）洗滌：孵育完抗體后添加500ul 漂洗緩沖液，移液器輕輕吹打懸浮 protein A/G 瓊脂糖珠，冰浴并置于搖床上5min，然后6000g 4℃ 離心30s，小心去除上清。重復(fù)此步驟3次。

（5）（可選）將洗滌后的protein A/G瓊脂糖珠與樣品在4℃孵育1小時(shí)后離心分離，以去除與IgG有非特異性結(jié)合的蛋白。

（6）取20ul吸附好抗體（目的抗體與IgG組各做一組）的protein A/G 瓊脂糖珠添加到100ul蛋白樣品中，置于搖床或者翻轉(zhuǎn)混合儀上室溫孵育2-4h或者4℃過(guò)夜孵育。孵育結(jié)束后，6000g 4℃ 離心30s，小心去除上清。可保留部分上清用于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)效果。

（7）洗滌：向（6）中去除上清的管子中添加500ul的漂洗緩沖液，吹打清洗瓊脂糖珠，并重復(fù)清洗3-5次。此步驟同時(shí)可向漂洗緩沖液中按照1:100的比例添加C0101 蛋白酶抑制劑，以減少蛋白的降解。

2.3 洗脫

酸洗脫：向清洗干凈的protein A/G 瓊脂糖珠（20ul）中添加50ul 洗脫緩沖液，吹打混勻后在搖床或者翻轉(zhuǎn)混勻儀上孵育5min，孵育時(shí)間不建議太長(zhǎng)，最長(zhǎng)不超過(guò)15min。

孵育結(jié)束后6000g 4℃ 離心30s，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中并添加5ul 中和緩沖液。為提高洗脫效率，洗脫步驟可重復(fù)1-2次。洗脫后的蛋白可在-20或-80長(zhǎng)期保存，或者借用于后續(xù)檢測(cè)分析。

變性洗脫：后續(xù)不用于其他檢測(cè)分析的話(huà)，可使用變性洗脫的方式，在洗滌獲得的protein A/G瓊脂糖珠中添加50ul 2*loading buffer ，95℃加熱5-10min。6000g 4℃ 離心30s，取上清可用于SDS-PAGE或WB檢測(cè)。

注意事項(xiàng)

1. 本試劑盒中提供的洗脫方式為酸洗脫，如不需回收beads也可添加 loading buffer 進(jìn)行煮樣洗脫。

2. 試劑盒提供的beads建議按照500ul樣品添加20ul磁珠混懸液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，具體用量可根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果再進(jìn)行調(diào)整。

3. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中如涉及到磷酸化修飾或乙?；鞍祝瑒t需要添加磷酸酶抑制劑或去乙?；种苿?/span>。

4. Beads使用前應(yīng)保證充分混勻，混勻方式不建議劇烈渦旋震蕩。

5. 本產(chǎn)品僅限專(zhuān)業(yè)人員科學(xué)研究使用，不可用于臨床診斷或者治療，不可存放于普通住宅內(nèi)。

6. 為了您的安全健康，請(qǐng)穿戴一次性手套操作。