諾博萊德 染料法qPCRMix

染料法qPCRMix   熒光定量

產(chǎn)品名稱：染料法qPCRMix
產(chǎn)品內(nèi)容：

 產(chǎn)品簡介
2× miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix是使用SYBR Green I嵌合熒光法進行qPCR的2×試劑。主要成分包括化學(xué)修飾的Hot Start Fast Taq DNA Polymerase、dNTP、Mg²⁺、SYBR Green I和針對qPCR優(yōu)化的最適Buffer。本產(chǎn)品可在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)獲得良好的標準曲線，實驗結(jié)果重復(fù)性好、可信度高。另外，預(yù)混液體系中添加了特殊ROX Reference Dye，適用于不同qPCR 儀器，配置反應(yīng)體系時只需加入引物和模板即可擴增，適用于動物、植物等miRNA的染料法熒光定量PCR。
注意事項
1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
2. 請于使用前確保產(chǎn)品wan全解凍，che底混勻后短暫離心，置于冰上備用。
3. 反復(fù)凍融會影響產(chǎn)品性能。如每次用量較少，推薦小份分裝使用。
4. 本產(chǎn)品中含熒光染料SYBR Green I，使用中應(yīng)盡量避免強光照射。
實驗流程
配制檢測試劑

1. 按照下表配置PCR反應(yīng)體系（注：配置多個反應(yīng)孔時，請為各組分預(yù)留10%的余量，以免移液損失。）

*通常每條引物終濃度為0.2 μM，也可根據(jù)情況在0.1~0.4μM 間進行調(diào)整。
*微量體積加樣時誤差大，建議模板稀釋后再加入反應(yīng)體系中，這樣可以有效提高實驗的重復(fù)性；如模板類型為未稀釋cDNA原液，使用體積不應(yīng)超過qPCR反應(yīng)總體積的 1/10。
 2. 反應(yīng)體系配好后，蓋好反應(yīng)蓋，充分渦旋混勻，離心，避免產(chǎn)生氣泡。
反應(yīng)程序設(shè)置

*延伸時間請根據(jù)您使用的Real Time qPCR儀數(shù)據(jù)采集最短時間限制以及PCR產(chǎn)物長度自行調(diào)整。
結(jié)果分析
定量檢測至少需要三個生物學(xué)重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后需要確認擴增曲線的線形，熔解曲線的峰形。
1. 擴增曲線：標準擴增曲線為S型。
Ct值小于10，需要將模板稀釋后，重新進行實驗（每稀釋一倍，Ct值增大1）；
Ct值30-35之間時，需要提高模板濃度，或者增大反應(yīng)體系的體積，以提高擴增效率，保證結(jié)果分析的準確性；
Ct值大于35時，檢測結(jié)果不可信。
2. 熔解曲線：
熔解曲線單峰，表明反應(yīng)特異性好可以進行定量結(jié)果分析；若熔解曲線出現(xiàn)明顯雙峰或者多峰，則不能進行定量分析，需要重新設(shè)計引物。
常見問題與解決方案
?擴增曲線形狀異常
①擴增曲線不光滑：確認所用ROX與機型是否匹配; 使用的八聯(lián)排管或PCR板可能與設(shè)備不匹配。
②擴增曲線突然驟降：反應(yīng)管內(nèi)留有氣泡。樣本離心后仔細檢查反應(yīng)管內(nèi)是否有氣泡殘留。
?反應(yīng)結(jié)束無擴增曲線出現(xiàn)
①循環(huán)數(shù)不夠：一般設(shè)置為40個循環(huán)。
②確認程序中是否設(shè)置了信號采集步驟。
③確認引物、模板是否降解。
④確認是否添加了ROX，嘗試將Passive Reference 設(shè)置為None，再重新分析數(shù)據(jù)。
?陰性對照出現(xiàn)擴增
①反應(yīng)體系污染：更換新的Mix、水、引物重復(fù)實驗。在超凈工作臺進行反應(yīng)體系配置，減少氣溶膠污染。
②產(chǎn)生引物二聚體，配合溶解曲線進行分析。
③使用含UDG/dUTP 防污染體系的擴增試劑。
?實驗重復(fù)性差
①加樣體積失準：建議使用大體積加樣以減少誤差。
②模板濃度太低：模板濃度越低，重復(fù)性越差，減少模板稀釋倍數(shù)或增加模板體積。
③反應(yīng)體系未充分混勻：上機檢測前將反應(yīng)體系充分混勻后再離心。

染料法qPCRMix   熒光定量