游離脂肪酸（FFA）含量試劑盒（測血清、動(dòng)物組織、微生物、細(xì)胞）

微量法 100 管/96 樣

游離脂肪酸FFA含量試劑盒

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

游離脂肪酸，也稱為非酯化脂肪酸，在與白蛋白結(jié)合的血漿中循環(huán)。動(dòng)物血液中的游離脂肪酸 (FFA )含量是一項(xiàng)重要的生理生化指標(biāo)。血清中游離脂肪酸的濃度與脂類代謝、糖代謝、內(nèi)分泌功能有關(guān)，游離脂肪酸的濃度會(huì)因?yàn)樘悄虿　⒅匕Y肝障礙、甲狀腺功能亢進(jìn)等疾病而上升。

測定原理：

用有機(jī)溶劑萃取 FFA。含有 FFA 的有機(jī)液與三乙醇胺銅反應(yīng),在有機(jī)相中形成脂肪酸銅 (銅皂) FFA 一 Cu。Cu 離子與顯色液反應(yīng)形成紫紅色絡(luò)合物。反應(yīng)形成的顏色深淺與 Cu 離子濃度的關(guān)系符合朗伯一比爾定律，因此可利用此反應(yīng)進(jìn)行比色。

組成：

自備儀器和用品：

酶標(biāo)儀、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96 孔板、蒸餾水。

樣本前處理：

動(dòng)物組織：按照動(dòng)物組織質(zhì)量（g）：萃取液ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml萃取液），進(jìn)行冰浴勻漿。震蕩提取 15min，5000 rpm 4℃離心 5min，取有機(jī)相待測。

血清：吸取 50 μl 血清樣本，加入 1 ml 萃取液，震蕩提取 15 min 后，4℃，5000 rpm 離心 5 min，取有機(jī)相待測。

微生物、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：萃取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1 ml 萃取液）加入萃取液，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 2 秒，間隔 3 秒，總時(shí)間 3min）；震蕩提取 15 min，然后 5000 rpm 4℃離心 5min，取有機(jī)相待測。

注意：有機(jī)相待測液可能存在于上層，也可能存在于下層，注意觀察，體積較多的那一層即為有機(jī)相待測液。

測定步驟：

1、酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 550 nm。

2、工作液的配制：臨用前根據(jù)用量按照試劑一（V）：試劑二（V）：試劑三（m）=1（ml）：1（ml）：0.66（g）的比例充分混勻。（注意：現(xiàn)用現(xiàn)配，用多少配多少，在空瓶中配制，試劑盒中帶有 4 個(gè)空瓶，先將試劑一與試劑二混合，最后再加入試劑三粉劑）

3、測定管：吸取600μl樣本，加入200μl工作液，蓋緊后震蕩20 min，4℃，5000 rpm離心5 min，分層后取200μl上層有機(jī)相，加入100μl試劑四，搖勻，10 min后測定550 nm的吸光值，記為A測定。

4、空白管：吸取600μl萃取液，加入200μl工作液，蓋緊后震蕩20 min，4℃，5000 rpm離心5 min，分層后取200μl上層有機(jī)相，加入100μl試劑四，搖勻，10 min后測定550 nm的吸光值，記為A空白。

空白管只需測一次。△A=A測定-A空白

注意：1、有機(jī)溶劑易揮發(fā)，加入96孔板后應(yīng)盡快檢測。

2、測定管中加入的樣本即樣本前處理中的有機(jī)相待測液。

FFA 含量計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0161x - 0.0141   R2 = 0.9985    x：棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/ml）

y：吸光值差值△A

1、血清FFA 含量計(jì)算：

FFA 含量(μmol/ml)=(△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V3×V1÷V2)÷1000

=1.242×(△A+0.0141)

2、動(dòng)物組織、微生物、細(xì)胞中 FFA 含量計(jì)算：

按樣本蛋白濃度計(jì)算

FFA 含量(μmol/g 鮮重)=(△A+0.0141)÷0.0161×V1÷（W× V1÷V2）÷1000

=0.062×(△A+0.0141)÷W

按樣本蛋白濃度計(jì)算

FFA 含量(μmo/mg prot)= (△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V1×Cpr)÷1000

=0.062×(△A+0.0141)÷Cpr

V1：加入樣本體積，0.6ml；V2：萃取液體積，1ml；V3：加入血清（漿）體積，0.05 ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：動(dòng)物組織樣品質(zhì)量，g； 1000：1 μmol=1000 nmol 。

注意事項(xiàng)：

蛋白含量不可直接用萃取液提取的有機(jī)相待測液直接測定，可用蒸餾水或緩沖液或生理鹽水選用本公司的BCA 法蛋白含量測定試劑盒。

最di檢出限為 20 nmol/ml。

游離脂肪酸FFA含量試劑盒