諾博萊德 高效sgRNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒

FlashPure sgRNASynthesis Kit高效 sgRNA 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒

目錄號:91615

產(chǎn)品內(nèi)容

保存條件： -20℃保存，有效期 12 個月。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

產(chǎn)品簡介

CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)是現(xiàn)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和育種研究等領(lǐng)域的常用手段。該技術(shù)體系僅需要Cas9蛋白和sgRNA即可實現(xiàn)高效的基因編輯，其中Cas9蛋白是通用組分（無需修改），sgRNA則需要根據(jù)不同靶位點來設(shè)計和轉(zhuǎn)錄。

高效sgRNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒采用T7 RNA聚合酶復(fù)合物高效轉(zhuǎn)錄spCas9sgRNA。試劑盒中的反應(yīng)體系根據(jù)sgRNA特點進行優(yōu)化，每個反應(yīng)可在4小時內(nèi)（實際操作為半天或1天之內(nèi)）獲得多達100~200μg的sgRNA。sgRNA可直接用Cas9蛋白體外切割，純化后可用于細胞注射等實驗。

試劑盒中配備了合成sgRNA轉(zhuǎn)錄模板，sgRNA轉(zhuǎn)錄所需的全部試劑，用戶僅需要合成含有1條CRISPR靶點的引物就能完成sgRNA體外轉(zhuǎn)錄。

操作步驟：

1. 設(shè)計PCR正向引物，替換標(biāo)紅的N(20)即可：

Primer Target：5’TAATACGACTCACTATAGGN(20)GTTTTAGAGCTAGAAATA -3’

注：spCas9識別的靶點為20nt，共20個堿基序列，N(20)為靶位點不包含PAM的20個堿基序列，建議避免選擇有3個（或3個以上）連續(xù)T堿基的位點。

2. 找公司合成Primer Target，稀釋到 1mM 濃度備用。

3. 配制PCR反應(yīng)體系：

4. 制備體外轉(zhuǎn)錄模板，設(shè)置反應(yīng)程序如下：

5. 按下表配制sgRNA轉(zhuǎn)錄體系，37℃反應(yīng)4 hours。（操作過程中采用無RNA酶耗材）

6. (可選步驟) 在反應(yīng)體系中加入1 μL的DNase I ，37℃孵育 15 min，消化轉(zhuǎn)錄的DNA模板。

7. 過柱純化：

提示：第一次使用前請先在 Wash Solution 1 瓶和 Wash Solution 2/3 瓶中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶上的標(biāo)簽，并做好標(biāo)記。sgRNA 容易降解，全程使用無酶耗材，請小心操作、避免降解。

（1）于冰上，用 RNase-Free H2O 將 RNA 樣品補足至 100 μL， 加入 200 μL Buffer MRC，輕柔混勻。

（2）加入 375 μL（1.25 倍體積）無水乙醇并混勻。

（3）將上一步所得溶液加入一套吸附柱中，13,000 rpm 離心 30 sec，棄濾液，將吸附柱重新套回收集管。

（4）加入 700 μl Wash Solution 1（請先檢查是否已加入無水乙 醇），13,000 rpm 離心 30 sec，棄濾液。

（5）漂洗：加入 500 μl Wash Solution 2/3，13,000 rpm 離心 30 sec，棄濾液。

（6）二次漂洗：重復(fù)步驟（5）一次。

（7）干燥：將離心吸附柱于 13,000 rpm 離心 2 min，甩干殘留的漂洗液。

（8）洗脫：將吸附柱放入一個新的 1.5 ml 離心管中，在吸附膜的中央懸空滴加 10 ~ 40 μl RNase-Free H2O，室溫放置 2 min，13,000 rpm 離心 1 min，收集 sgRNA，用于后續(xù)實驗。