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北京諾博萊德科技有限公司
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當(dāng)前位置:北京諾博萊德科技有限公司>>分子生物學(xué)試劑>>TOPO載體(TA/Blunt Cloning Kit)>> 42117TOPO-Blunt Simple Lightning Cloning Kit

TOPO-Blunt Simple Lightning Cloning Kit

參  考  價面議
具體成交價以合同協(xié)議為準

產(chǎn)品型號42117

品       牌NobleRyder/諾博萊德

廠商性質(zhì)生產(chǎn)商

所  在  地北京市

更新時間:2025-04-24 08:50:09瀏覽次數(shù):43次

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供貨周期 現(xiàn)貨 規(guī)格 20次/80次/20次(含感受態(tài))/80次(含感受態(tài))
貨號 42117 應(yīng)用領(lǐng)域 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,制藥/生物制藥
主要用途 TOPO-Blunt Simple Lightning Cloning Kit
可在室溫條件下,20分鐘完成TA克隆或Blunt克隆,陽性率接近100%,并且免冰浴、免熱激、免藍白斑篩選,還可以連接長達10kb的DNA片段。
TOPO-Blunt Simple Lightning Cloning Kit

諾博萊德 TOPO-Blunt Simple Lightning Cloning Kit


TOPO-Blunt Simple Lightning Cloning Kit 

目錄號42117

產(chǎn)品內(nèi)容:

產(chǎn)品成份

42117-20 (20 rxn)

42117-80(80 rxn)

pTOPO-TA/Blunt Vector(30ng/ul)

20 ul

80 ul

1000bp Control (30ng/ul)

5 ul

5 ul

10x Enhancer

20 ul

80 ul

保存條件:

-20℃,存放 12 個月,不影響使用效果。


具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準


產(chǎn)品簡介:

可在室溫條件下,20分鐘完成TA克隆或Blunt克隆,陽性率接近100%,并且免冰浴、免熱激、免藍白斑篩選,還可以連接長達10kb的DNA片段。

克隆步驟(≤3kb 片段)               

簡化步驟(≤10kb 片段-- 免復(fù)蘇,免液體 LB

1、連接:室溫 5 分鐘;                      1、連接: 37℃連接 5 min。

2、轉(zhuǎn)化:室溫 5 分鐘;                      2、轉(zhuǎn)化:冰浴 5 min,42℃熱激 1 min,冰上 2 min。

3、復(fù)蘇:180rpm、37℃振蕩培養(yǎng) 10 分鐘;涂板。 3、取全部菌液涂板,37℃倒置培養(yǎng)。

操作步驟:

1.         PCR 產(chǎn)物的制備:

a.       引物要求:引物不能磷酸化。

b.     酶的選擇:根據(jù)需要選擇DNA 聚合酶,該載體兼容PCR 產(chǎn)物的A 末端和平末端。

c.        電泳檢測 PCR 產(chǎn)物的量和質(zhì)量:

①僅有目的條帶,可直接進行連接反應(yīng),無需純化;

②如果有多條帶,建議凝膠回收 DNA 片段(DC011-100);

③如果以質(zhì)粒為模板的擴增,則必須進行凝膠回收,因為模板質(zhì)粒也會長出非目的菌落。

2.         連接反應(yīng):

1)室溫(20℃-37℃)建立連接體系(10ul 體系):

純化后的 PCR 產(chǎn)物

0.5-8ul

pTOPO-TA/blunt Vector

1ul

10 ? Enhancer

1 ul

滅菌水

X ul

總體積

10 ul

不同大小插入片段的推薦用量:

插入片段大?。╞p)

最佳用量(ng)

100-1000

10-40

1000-2000

40-80

2000-5000

80-150

加完試劑后,輕彈管底混勻(或輕輕吹打混勻,點甩離心收集所有液體在離心管底。

2) 室溫(20℃-37℃)連接 5 分鐘。連接產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞,或置于冰上備用。

3.         轉(zhuǎn)化、復(fù)蘇、涂板:

1)100ul 感受態(tài)細胞,置于室溫解凍(約 1 分鐘左右),輕撣幾次將細胞均勻懸浮。

2)     加入 10ul 連接液,輕輕混勻,室溫(20℃-37℃)放置 5 分鐘。

3)      加入 500ul 平衡至室溫的 LB 或者 SOC 培養(yǎng)基(不含抗生素),37℃ 180 rpm 振蕩培養(yǎng) 10 min。

注意:大于 3kb 的片段,振蕩培養(yǎng)時間延長至 30-60 分鐘,可以增加轉(zhuǎn)化子。或者用簡化步驟

4)        取 200?l 菌液涂板(含氨芐qing霉素 50-100ug/ml),培養(yǎng)過夜。(為得到較多克隆,4000 rpm 離心 1 min,吸棄掉部分上清,保留 100-150ul,輕彈懸浮菌體,取全部菌液涂板)

注意:如果使用 5ul 體系,各成分按照比例減半,使用次數(shù)可以加倍。

4.         轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定:

本制品陽性率相當(dāng)高,一般情況下,可以達到所見即所得,只要是長出來的菌落正常(不是污染的雜菌,轉(zhuǎn)化子數(shù)量也不算太少,基本就包含插入。因此插入片段不超過 2-3kb 的情況下可以不用鑒定直接挑 1-2 個菌去測序。

1)     菌落 PCR 檢測:挑單菌落于 10ul 無菌水中,混勻,取 1ul 置于 25ul PCR 體系,用 PCR 引物或者M13 通用引物去鑒定陽性克隆。

2)用通用 M13F(-20)/M13R(-26)引物測序來確定是否含有目的克隆。


 

pTOPO-TA/Blunt  載體通用測序引物序列:

M13F-20: TGTAAAACGACGGCCAGT M13R-26: CAGGAAACAGCTATGACC

注意:不要用錯引物,M13 通用引物有多種。

pTOPO-TA/Blunt 載體序列:


 


 

pTOPO-TA/Blunt  載體通用測序引物序列:

M13F-20: TGTAAAACGACGGCCAGT M13R-26: CAGGAAACAGCTATGACC

注意:不要用錯引物,M13 通用引物有多種。


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