甲醛脫氫酶（Formaldehyde Dehydrogenase，FDH）試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100T/96S

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

甲醛是一種能與蛋白質(zhì)、核酸和脂類產(chǎn)生非特異性反應(yīng)的活潑化合物，對(duì)所有生物都具有很高毒性。甲醛脫氫酶作為含鋅中等鏈醇脫氫酶（ADH）的家庭成員之一，廣泛存在于原核和真核生物中，該酶能利用NAD⁺作為輔酶，將有毒的甲醛氧化，是甲醛氧化途徑中的關(guān)鍵酶。

測(cè)定原理：

甲醛脫氫酶催化甲醛和 NAD⁺產(chǎn)生NADH，在 340nm 處的吸光值會(huì)增加，測(cè)定 340nm 處的吸光值變化，可計(jì)算得到甲醛脫氫酶的活性。

甲醛脫氫酶試劑盒   輔酶Ⅰ系列-常備現(xiàn)貨

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 6ml 水溶解待用，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1 支，4℃保存；臨用前加入 1.5ml 水溶解待用。

自備儀器和用品：

天平、離心機(jī)、酶標(biāo)儀、96 孔板、蒸餾水。

FDH 提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后 10000g，4℃，離心 20min。

2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1ml提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 10000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3. 液體：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作表：

1、酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm。

2、操作表

在 96 孔板中加入如下試劑

混勻，于 340nm 下測(cè)定初始吸光值A1 與 5min 后的吸光值A2，△A=A2-A1。若樣本數(shù)量較多，可將試劑按比例配成工作液使用。

FDH 酶活計(jì)算：

（1） 按蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘催化還原 1nmol NAD⁺的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

FDH 酶活（nmol/min/mg prot）=

（2） 按樣本質(zhì)量計(jì)算

DA ×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T = 643×△A÷Cpr e′ d

酶活定義：每克樣品每分鐘催化還原 1nmol NAD⁺的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

FDH 酶活（nmol/min/g 鮮重）=

（3） 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

DA ×V 反總÷（V 樣×W÷V 樣總）÷T =643×△A÷W e′ d

酶活定義：每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化還原 1nmol NAD⁺的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

FDH 酶活（nmol/min/10⁴cell）=數(shù)量

（4） 按液體體積計(jì)算

DA ×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)））÷T= 643×△A÷細(xì)胞 e′ d

酶活定義：每ml 樣本每分鐘催化還原 1nmol NAD⁺的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

FDH 酶活（nmol/min/ml）=DA ×V 反總÷V 樣÷T=643×△A e′ d

e：NADH 微摩爾消光系數(shù)，6.22×10^-3 L/µmol/cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積， 0.2ml；V 樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.02ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T，反應(yīng)時(shí)間，5min；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g

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