精品国产亚洲国产亚洲,久热中文在线观看精品视频,成人三级av黄色按摩,亚洲AV无码乱码国产麻豆

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

本產(chǎn)品是包涵體微量純化試劑盒的大提升級(jí)產(chǎn)品，用于大量，快速的提取高質(zhì)量的包涵體。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.大量提取，1 次可處理多達(dá) 5 升的菌液，相當(dāng)于 50 次中量提取。

2.適合制備級(jí)別的包涵體純化，需在 50 mL 以上的離心管或離心瓶中完成。

3.能有效去除包涵體中的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜等非重組蛋白成份，使重組蛋白在包涵體中所占比重達(dá)到 60%以上。

4.本產(chǎn)品主要用于從大腸桿菌宿主中純化包涵體，也能用于真菌和其他表達(dá)系統(tǒng)，  但純化條件（主要是細(xì)胞裂解條件需要自行優(yōu)化）。

5.對(duì)大腸桿菌宿主，本手冊(cè)提供高壓裂解和酶學(xué)裂解兩種破碎細(xì)菌，超聲打斷DNA 的實(shí)驗(yàn)方案。

6.得到的包涵體可以用于重折疊，也可以用于凝膠層析和動(dòng)物免疫。

7.本產(chǎn)品足夠 2 次純化，每次可以處理 5 升菌液。

8.大量包涵體純化試劑盒只可用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

保存和運(yùn)輸

常溫運(yùn)輸和保存（溶菌-酶需要-20℃保存，包涵體溶解液可以室溫保存），有效期一年。

自備試劑

如果得到的重組蛋白確有降解則需要自備蛋白酶抑制劑混合物。

使用方法：

一、細(xì)胞沉淀

1.轉(zhuǎn)移 1-5 升的菌液到干凈的、預(yù)稱重量的塑料離心瓶中。如果離心瓶體積不夠大，可以分多次反復(fù)離心收集。

2.5,000 g（相當(dāng)于 Sorvall GSA 轉(zhuǎn)頭 5500 rpm）4℃離心 15-30 分鐘，小心棄上清。

3.復(fù)稱重量，差值就是細(xì)菌的濕重。1 升的過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌濕重一般為 3 克， 所以 1-5 升菌液一般能得到 3-15 克細(xì)菌。注意：后續(xù)操作的很多溶液都是按此步得到得細(xì)胞濕重添加。

4.細(xì)胞沉淀可以立即使用或存放在-80℃待用。

二、高壓破碎法（French Press）+超聲法裂解細(xì)菌（推薦方法）

1.按每克細(xì)菌濕重加入 3 mL 包涵體純化溶液 A 重懸細(xì)胞，1-5L 的菌液得到的細(xì)菌沉淀一般是 3-15g，故需要加入 9-45mL 包涵體純化溶液 A。加入后可以用玻璃棒攪拌或用 Waring 搗碎機(jī)勻漿（如果細(xì)菌濕重超過(guò) 10 克）使細(xì)菌懸浮，直到檢測(cè)不到成塊的細(xì)胞為止。

2.留少量樣品做未裂解對(duì)照，剩余得樣品通過(guò)壓力為 16000-18000 lb/in2 的高壓細(xì)胞破碎儀裂解，收集的細(xì)胞裂解液需放冰上，顯微鏡下檢查裂解前和裂解  后完整細(xì)菌得數(shù)量，反推出裂解細(xì)菌的比例。

3.重復(fù)上步操作一次或多次，直到在顯微鏡下觀察不到或只能觀察到非常少的完  整細(xì)菌。

4.一般經(jīng)過(guò)多次高壓細(xì)胞破碎的裂解液不會(huì)非常粘稠（DNA 被打斷）。如果還是非常粘稠，將細(xì)胞裂解液置于冰浴中，用超聲破碎儀滿功率下超聲處理打斷DNA，工作狀態(tài)為 50%（開(kāi) 0.5 秒，關(guān) 0.5 秒），直到不再粘稠為止。此進(jìn)行此操作時(shí)，最好將細(xì)胞裂解液放冰上并用磁力攪拌器攪拌，否則產(chǎn)生的熱量會(huì)  使包涵體蛋白變性，在純化中丟失。

三、酶法+超聲法（在沒(méi)有高壓破碎儀器時(shí)的候選方法）

5.按每克細(xì)菌濕重加入 3 mL 包涵體純化溶液 A 重懸細(xì)胞，1-5L 的菌液得到的細(xì)菌沉淀一般是 3-15g，故需要加入 9-45mL 包涵體純化溶液 A。加入后可以用玻璃棒攪拌或用 Waring 搗碎機(jī)勻漿（如果細(xì)菌濕重超過(guò) 10 克）使細(xì)菌懸浮，直到檢測(cè)不到成塊的細(xì)胞為止。

6.在細(xì)菌懸浮液中加入溶菌-酶干粉，使其終濃度為120mg/mL（45mL 加5.4g），攪拌混勻后 37℃放置 30 分鐘裂解細(xì)菌，其間不時(shí)需要用玻璃棒混勻。細(xì)菌釋放出的 DNA 將使裂解物變得十分粘稠。如果不粘稠，說(shuō)明裂解不充分，需要繼續(xù)裂解，否則完整細(xì)菌將和包涵體一起沉淀，影響包涵體的純度。最好在顯微鏡下檢查細(xì)菌是否充分裂解。

7.將細(xì)胞裂解液置于冰浴中，用超聲破碎儀滿功率下超聲處理打斷 DNA，工作狀態(tài)為 50%（開(kāi) 0.5 秒，關(guān) 0.5 秒），一般需要 5 分鐘。具體可以根據(jù)溶液粘稠度決定。此進(jìn)行此操作時(shí)，最好將細(xì)胞裂解液放冰上并用磁力攪拌器攪拌，否則產(chǎn)生的熱量會(huì)使包涵體蛋白變性，在純化中丟失。

四、包涵體純化

8.將超聲處理后的細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到離心瓶中，7000g 4℃下高速離心 60 分鐘

（注意：轉(zhuǎn)子不同 7000g 對(duì)應(yīng)的離心速度不同），小心收集上清。上清含有以可溶形式存在的重組蛋白，可以保留作為 SDS-PAGE 對(duì)照樣品。

9.將沉淀（主要由包涵體構(gòu)成）懸浮在預(yù)冷的包涵體純化溶液 B 中。每克細(xì)菌需要 5 mL 包涵體純化溶液溶液 B，1 升細(xì)菌的濕重約 3 克，大約需要 15 mL， 用玻璃棒或勻漿器攪拌混勻后室溫放置 5 分鐘。

10.7000g 4℃下高速離心 30 分鐘，沉淀將出現(xiàn)三層，最下面的是未徹-底破裂的細(xì)胞碎片，其上是包涵體，最上層的松軟沉淀是細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜。如果處理  過(guò)程中使用過(guò)溶菌-酶，則此層較薄。小心收集上清，可以作為包涵體第一次洗  滌的對(duì)照樣品。

11.重復(fù)第 9-10 步直到上清變清和最上層細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜松軟沉淀消失，此過(guò)程一般需要重復(fù)洗滌 2 次（共 3 次洗滌），小心收集上清作為包涵體第二次洗滌和第三次洗滌的對(duì)照樣品。本試劑盒提供的包涵體純化溶液 B 足夠一次 5 升規(guī)模的提取洗 3 次，如需更多包涵體純化溶液 B 請(qǐng)單獨(dú)購(gòu)買。

12.上步得到的沉淀即為包涵體，其中重組蛋白一般占 60%重量，其余 40%為其他蛋白質(zhì)。此沉淀可以長(zhǎng)期放置在-80℃冰箱待用，也可以直接用于免疫動(dòng)物制備抗體，還可以直接進(jìn)入下面得包涵體的溶解步驟。

13.估計(jì)重組蛋白的產(chǎn)率：首先需要通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)知道重組蛋白的表達(dá)水平，如果表  達(dá)水平為 1%，則 1 克濕重的細(xì)菌中將含有 1 mg 重組蛋白質(zhì)。此法得到的重組蛋白質(zhì)的回收率一般在 75%，即 1mg 重組蛋白質(zhì)能得到 0.75 mg，丟失0.25mg。

五、包涵體的溶解

14.在室溫下，將包涵體溶解液加入到包涵體沉淀中，用槍頭充分吹打后漩渦震蕩。  如果需要將溶解的包涵體直接用于凝膠過(guò)濾層析進(jìn)一步純化，則按每克原始細(xì)胞濕重加入 1 mL 包涵體溶解液，重組蛋白的濃度約為 4-5 mg/mL；如果需要將溶解的包涵體直接用于蛋白質(zhì)折疊，則按每克原始細(xì)胞濕重加入 3 mL 包涵體溶解液，重組蛋白的濃度約為 1-2 mg/mL；注意：包涵體溶解液低溫放置會(huì)產(chǎn)生沉淀，必須 45-65℃溶化并混勻后才能使用。注意：包涵體溶解液含6M 鹽酸胍，溶解蛋白能力強(qiáng)于含 8M 尿素的溶解液，但 SDS-PAGE 時(shí)不能直接上樣。客戶可用自備的尿素配制 8-10 M 尿素的溶液（尿素溶液不穩(wěn)定， 所以不能長(zhǎng)期放置）溶解包涵體，得到的溶解液可以直接用于 SDS-PAGE 或后續(xù)純化。但其溶解能力弱于鹽酸胍。

15.室溫放置 1 小時(shí)使蛋白質(zhì)充分溶解。

16.7000g 4℃離心 60 分鐘(轉(zhuǎn)速需要根據(jù)離心機(jī)轉(zhuǎn)子的大小換算)，小心收集上清，保留不溶性沉淀。注意：檢查離心管能否承受此離心力。含溶解蛋白的上清脫鹽后，可以進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，檢查是否大部分重組蛋白都在上清中。如果沒(méi)有，說(shuō)明包涵體沒(méi)有完-全溶解，需要用適當(dāng)增加包涵體溶解液的用量。

17.將上清（溶解的包涵體）分成 10-20mL 一份，放于塑料離心管中（不要超過(guò)離心管容量的 70%）置-80℃長(zhǎng)期保存或直接用于復(fù)性等試驗(yàn)。由于不同的蛋白質(zhì)有不同的優(yōu)良復(fù)性條件，需要用戶自己摸索。包涵體純化過(guò)程中引入了溶

菌-酶，在 SDS-PAGE 分析時(shí)可能有額外條帶出現(xiàn)。

選擇我們的大量包涵體純化試劑盒，就是選擇精準(zhǔn)、高效、可靠的檢測(cè)方案，為您的科研實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航！