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產(chǎn)品簡介：

端粒是位于染色體末端的重復(fù)TTAGGG 序列和核蛋白的復(fù)合物，在維持細胞增 殖和保持基因組完整性方面起著至關(guān)重要的作用。由于端粒區(qū)域復(fù)制不完-全和成體細胞中端粒酶 TERT 的低活性，增殖體細胞中的端粒長度隨著年齡的增長而逐漸縮短。端粒長度的縮短導(dǎo)致細胞周期停滯，細胞衰老和體細胞凋亡。端粒長度的維持，使癌細胞逃脫端粒介導(dǎo)的細胞死亡途徑，是與癌癥標志相關(guān)的一個特征。

本產(chǎn)品通過熒光定量 PCR 技術(shù)，使用 SYBR 綠色熒光染料，作為 DNA 結(jié)合染料，和擴增子上雙鏈 DNA 的任一小溝結(jié)合，而發(fā)出熒光信號。根據(jù)每一循環(huán)的熒光強度來確定擴增產(chǎn)物的產(chǎn)量，并用循環(huán)閾值（threshold cycle；Ct）表示，由此定量測定猴端?；驍U增產(chǎn)量（Ct）和參考基因 36B4 單拷貝基因擴增產(chǎn)量（Ct），與相應(yīng)的端粒長度和基因拷貝標準曲線，進行對照測算，來確定猴基因組的端粒長度。

產(chǎn)品特點：

1.操作簡便易行。

2.本試劑盒足夠 20 個樣本的探針法熒光定量PCR 反應(yīng)。

3.本試劑盒運用 SYBR 綠色熒光染料作為標記信號。

4.產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，無核酶污染，敏感高效，定量準確，重復(fù)性強。

5.可以被用于動物細胞和組織等樣本端粒長度的定量檢測。

6.猴端粒長度檢測試劑盒(染料法 qPCR)只能用于科研，不能用于臨床。

產(chǎn)品參數(shù)：

成分規(guī)格包裝

猴端粒長度檢測反應(yīng)液××微升本色管

猴端粒長度檢測染色液××微升本色管

猴端粒長度檢測標準端粒液××微升本色管

猴端粒長度檢測標準內(nèi)參液××微升本色管

猴端粒長度檢測端粒引物液××微升本色管

猴端粒長度檢測端粒

內(nèi)參引物液××微升本色管

猴端粒長度檢測補充液××毫升本色瓶

猴端粒長度檢測封隔液××毫升本色瓶

使用手冊1 份無

運輸及保存

低溫運輸，-20℃避光保存，有效期半年。

自備試劑

臺式離心機，1.5 毫升離心管，PCR 管，熒光定量PCR 儀 。

使用方法：

一、標準端粒樣品制備

1.準備好 7 個無菌的 1.5 毫升離心管，標記為T1 至 T5 號管

2.按下表分別加入××微升的猴端粒長度檢測補充液到 T2 至T5 管。

3.移取××微升猴端粒長度檢測標準端粒液到 T1 號管。

4.小心移取××微升 T1 號管的猴端粒長度檢測標準端粒液到T2 號管，混勻。

5.小心移取××微升 T2 號管稀釋的猴端粒長度檢測標準端粒液到T3 號管，混勻。

6.小心移取××微升 T3 號管稀釋的猴端粒長度檢測標準端粒液到T4 號管，混勻。

7.以此類推。

8.將 T1 至T5 號管放進冰槽里備用；標準管濃度見下表

管號猴端粒長度檢測補充液猴端粒長度檢測標準端粒液標準端粒長度

T1——××微升1.18 × 108Kb

T2××微升××微升 1 號管1.18 × 107 Kb

T3××微升××微升 2 號管1.18 × 106 Kb

T4××微升××微升 3 號管1.18 × 105 Kb T5××微升空白對照空白對照

二、標準參考基因樣品制備

9.準備好 7 個無菌的 1.5 毫升離心管，標記為 S1 至 S6 號管。

10.按下表分別加入××微升的猴端粒長度檢測補充液到 S2 至 S6 管。

11.移取××微升猴端粒長度檢測標準內(nèi)參液到 S1 號管。

12.小心移取××微升 S1 號管的猴端粒長度檢測標準內(nèi)參液到 S2 號管，混勻。

13.小心移取××微升 S2 號管稀釋的猴端粒長度檢測標準內(nèi)參液到 S3 號管，混勻。

14.小心移取××微升 S3 號管稀釋的猴端粒長度檢測標準內(nèi)參液到 S4 號管，混勻。

15.以此類推。

16.將 S1 至 S6 號管放進冰槽里備用；標準管濃度見下表

管號猴端粒長度檢測

補充液猴端粒長度檢測

標準內(nèi)參液標準參考基因拷貝數(shù)

S1——××微升2.63 ×109 拷貝數(shù)/基因組

S2××微升××微升 1 號管2.63 ×108 拷貝數(shù)/基因組

S3××微升××微升 2 號管2.63 ×107 拷貝數(shù)/基因組

S 4××微升××微升 3 號管2.63 ×106 拷貝數(shù)/基因組

S5××微升××微升 4 號管2.63 ×105 拷貝數(shù)/基因組

S6××微升空白對照空白對照

三、 定量檢測

17.準備好純化的待測 DNA 樣品。

18.進行 DNA 定量測定。

19.準備好 PCR 管，并標記為標準端粒管、標準內(nèi)參管、待測樣品端粒管、待測樣品內(nèi)參管、端粒陰性對照管和內(nèi)參陰性對照管。

20.每管PCR 反應(yīng)總量為 20 微升。

21.分別移取×微升猴端粒長度檢測反應(yīng)液到所有管里。

22.分別加入××微升待測 DNA 模板（總 20 納克）到待測樣品端粒管和待測樣品內(nèi)參管里。

23.分別加入××微升猴端粒長度檢測補充液到端粒陰性對照管和內(nèi)參陰性對照管里。

24.分別加入4××升上述配制的系列猴端粒長度檢測標準端粒液和猴端粒長度檢測標準內(nèi)參液到相應(yīng)的標準端粒管和標準內(nèi)參管里。（注意：各選取 4 個點（105 至 108）即可）

25.分別加入××微升猴端粒長度檢測端粒引物液到標準端粒管、待測樣品端粒管和端粒陰性對照管里。

26.分別加入××微升猴端粒長度檢測內(nèi)參引物液到標準內(nèi)參管、待測樣品內(nèi)參管和內(nèi)參陰性對照管里。

27.分別加入××微升猴端粒長度檢測染色液到所有管里。

28.分別加入××微升猴端粒長度檢測補充液到所有管里。

29.放進 4℃微型臺式離心機瞬時離心 5 秒。

30.使用××微升槍頭分別加入 1 滴猴端粒長度檢測封隔液到所有管里。

31.即刻放進熒光定量PCR 儀。

32.熒光定量PCR 反應(yīng)程序為。

溫度（℃）時間循環(huán)

955 分鐘1

95

60

7230 秒

30 秒

30 秒

40

33.進行數(shù)據(jù)分析

（1）采集數(shù)據(jù)，進行擴增曲線分析。（退火溫度進行熒光信號采集）

（2）獲得所有樣品的 Ct 值。

（3）分別構(gòu)建端粒長度和基因組拷貝數(shù)標準曲線：縱座標（Y 軸）為 Ct 值；橫座標（X 軸）。為對數(shù)標準端粒長度（Kb）或?qū)?shù)標準基因組拷貝數(shù)。

（4）根據(jù)標準曲線獲得樣品對應(yīng)端粒長度（Kb）或基因組拷貝數(shù)。

（5）計算樣品實際端粒長度（Kb）/基因組：

實際總端粒長度（Kb）/基因組=樣品總端粒長度（Kb）÷樣品基因組拷貝數(shù)

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