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產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

本試劑盒是基于沙門氏噬菌體T3 RNA 聚合酶的RNA 體外轉(zhuǎn)錄及加帽試劑盒，它利用含有 T3 啟動(dòng)子的模版 DNA，以 NTP 和 m7G(5' )ppp(5' )G 為底物從 T3 啟動(dòng)子下游開始合成與模板 DNA 中一條鏈互補(bǔ)的 RNA，簡(jiǎn)單快速獲得大量的 RNA 分子（含帶帽 RNA）。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.即開即用，用戶只需提供含 T3 啟動(dòng)子的 DNA 模板即可以進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，不需單獨(dú)準(zhǔn)備每一個(gè)成份。

2.體外轉(zhuǎn)錄和加帽同管一步式進(jìn)行，不需要先體外轉(zhuǎn)錄再加帽。

3.單溶液預(yù)配液，減少加樣次數(shù)，避免了操作誤差，增加了可重復(fù)性。

4.模板 DNA 可以是線性化的質(zhì)粒 DNA，也可以是 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。

5.可以合成的 RNA 的最佳長(zhǎng)度在 20nt 到 5000nt 之問。

6.產(chǎn)品配方經(jīng)過精心優(yōu)化，每μg DNA 模板可以合成 2-6μg RNA。

7.得到的加帽 RNA 比不加帽的 RNA 更穩(wěn)定，可以用于 RNA 結(jié)構(gòu)研究、核解生物化學(xué)、體外翻譯、RNA-蛋白質(zhì)相互作用、反義技術(shù)、SELEX 技術(shù)和 RNA 干擾（RNAi）等實(shí)驗(yàn)。

產(chǎn)品參數(shù)：

成份規(guī)格包裝

2×T3 體外轉(zhuǎn)錄及加帽預(yù)配液50μL0.1mL 本蓋管

T3 RNA 聚合酶-RI 混合液5μL10μL 紅蓋管

RNase-free 水1mL1mL 藍(lán)蓋管

使用手冊(cè)1 份無

保存和運(yùn)輸

T3體外轉(zhuǎn)錄及加帽試劑盒低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑

如果需要去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的 DNA 模板，則需要 RNase-free DNase、Tris 飽和

酚、氯仿、微量核酸沉淀劑、RNase-free 75%乙醇。

使用方法：

一、制備 DNA 模板

PCR 片段和質(zhì)粒 DNA 都可以用作體外轉(zhuǎn)錄的模板，但是必須注意以下幾點(diǎn)。一是必須使用線性化的 DNA。如果是質(zhì)粒 DNA，則必須先用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切成線狀。二是需要轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列的上游必須有 T3 啟動(dòng)子。如果模板是 PCR 產(chǎn)物， 則可以在設(shè)計(jì)引物時(shí)將 T3 啟動(dòng)子序列

（5’AATTAACCCTCACTAAAGG 3’）加上。如果是將 DNA 片段克隆

到載體上，則需要選擇有 T3 啟動(dòng)子的載體，并且克隆位點(diǎn)必須位于 T3 啟動(dòng)子下游。三是需要轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列的下游端最好不要是 3’突出。如果

是 3’突出（如選擇了 Pst I 來線性化質(zhì)粒），則最好用 T4 DNA 聚合酶修平。四是必須保證 DNA 模板中沒有 RNase。由于提取質(zhì)粒 DNA 的過程中一般要使用大量的 RNase A，因此質(zhì)粒 DNA 一般都有嚴(yán)重的 RNase A 污染，所以在用作模板前，最好采取膠回收得方法回收質(zhì)粒 DNA。并且加入少量總 RNA 一起保溫，然后電泳檢測(cè) RNA 是否被降解，以此判斷純化的DNA 模板是否有殘留 RNase A。

二、體外轉(zhuǎn)錄及加帽反應(yīng)

1.如果有 N 個(gè)樣品，強(qiáng)烈建議做一個(gè)陰性對(duì)照，故共設(shè)置 N+1 個(gè)反應(yīng)，這樣一起并排電泳時(shí)容易判斷哪個(gè)條帶是模板 DNA，哪個(gè)條帶是擴(kuò)增得到的RNA。在 N+1 個(gè) RNase-free 的塑料離心管中，在室溫下（不是在 4℃下）按次序加入下列成分：

注：此為 20μL 反應(yīng)體系的用量，對(duì)其他體積的反應(yīng)體系，各成分的用量可以按比例增減。如果需要標(biāo)記 RNA 探針，則需要另購(gòu) NTP 與 2×T3 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液分開提供的試劑盒。

2.37℃保溫 1-2 小時(shí)。注意：延長(zhǎng)保溫時(shí)間并不能提高產(chǎn)量。

3.70℃加熱 10 分鐘滅活 T3 RNA 聚合酶。

4.取 1-3μL 電泳檢測(cè)轉(zhuǎn)錄效果。比陰性對(duì)照多出的條帶就是擴(kuò)增得到的 RNA

（由于檢測(cè)時(shí)的電泳不需要堿變性膠，并且合成的 RNA 長(zhǎng)度不一定均勻， 即使長(zhǎng)度均勻，但由于自生形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，因此不一定呈現(xiàn)清晰的電泳條帶。但由于 RNA 是單鏈，分子量比同樣長(zhǎng)度的 DNA 小一倍，因此轉(zhuǎn)錄得到的 RNA 一般比其模板電泳速度更快。

5.定量，可以用自備的單鏈 RNA 定量試劑盒檢測(cè)濃度，也可以肉眼比較電泳膠上 RNA 和 DNA 的強(qiáng)度。由于 RNA 是單鏈，跟核酸染料結(jié)合力低，因此同等亮度的 RNA 條帶，其 RNA 分子數(shù)一般比 DNA 的分子數(shù)多一倍。1 μg DNA 模板一般可以合成 2-6μg 的 RNA（含帶帽 RNA）。

得到的 RNA 可以放-80℃保存（溶液中有 DNA 模板和未使用的 NTP）。注：若需進(jìn)一步去除 T3 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中的 DNA 模板，可參考下列操作步

驟，但所用試劑需另行購(gòu)買，本試劑盒不提供。

1.  在體外轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，在反應(yīng)體系中加入 3-5 U 自備的 RNase-free DNase。 2. 37℃保溫 15-30 分鐘。

3.補(bǔ)水到 100μL，

4.用自備的等體積（100μL）的 Tris 飽和酚-氯仿抽提一次去除殘留的 DNase和 RNA 聚合酶。

5.在上清中加 200μL 自備的微量核酸沉淀劑（CAT#50903；用前需要搖晃混勻），振蕩后 15000 rpm 離心 3-5 分鐘，棄上清。

6.加入 1mL 75%乙醇，震蕩 10 秒后 15000 rpm 離心 3-5 分鐘，棄上清。

7.短暫離心數(shù)秒，用槍頭吸棄上清。

8.晾干半分鐘，所得沉淀即去除 DNA 模板后的 RNA。可溶于 RNase-free水中后立即使用或放-80℃長(zhǎng)期保存。

選擇我們的T3體外轉(zhuǎn)錄及加帽試劑盒，就是選擇精準(zhǔn)、高效、可靠的檢測(cè)方案，為您的科研實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航！