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產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

DNA Shuffling 即 DNA 分子的體外同源重組，它是一種分子水平上的定向進(jìn)化(directed evolution)技術(shù)。DNA Shuffling 以一個(gè)或多個(gè)基因?yàn)槠鹗疾牧?，通過先隨機(jī)將這些基因斷裂成 DNA 短片段，再進(jìn)行互為模板和引物的 PCR（無外加引物），最后再進(jìn)行常規(guī) PCR（外加引物）等處理，最后得到含有大量 DNA 重組突變的 PCR 產(chǎn)物。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板，無需單獨(dú)準(zhǔn)備各成分。

2.可以用于對(duì)長(zhǎng)度在 1000 bp 左右的同源片段進(jìn)行 DNA shuffling。

3.操作手冊(cè)經(jīng)過優(yōu)化，只產(chǎn)生 DNA Shuffling，而將點(diǎn)突變的幾率減低到最-低，節(jié)省大量?jī)?yōu)化時(shí)間。

4.本產(chǎn)品足夠 10 次 DNA Shuffling 反應(yīng)。

5.DNA Shuffling 試劑盒只適用于科研，不能用于臨床。

產(chǎn)品參數(shù)：

成分規(guī)格包裝

DNase I 溶液（1U/μL）10 μL0.5 mL 紅蓋管

DNA Shuffling 專用反應(yīng)液 A，10×100 μL0.5 mL 綠蓋管

DNA Shuffling 專用反應(yīng)液 B，10×100 μL0.5 mL 紫蓋管

2×DNA Shuffling 專用無引物 PCR

MasterMix1 mL1.5 mL 白蓋管

2×DNA Shuffling 專用帶引物 PCR

MasterMix1 mL1.5 mL 黃色管

超純水1 mL1.5 mL 藍(lán)蓋管

使用手冊(cè)1 份無

運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限一年。

自備試劑

待突變基因片段、DNA Shuffling 引物（第二輪PCR 引物）、膠回收試劑盒。

使用方法：

1.提前開啟 37℃和 90℃水浴或金屬浴。一：待突變基因片段的制備

2.待突變基因片段可以用來源于多個(gè)物種的、含同源基因片段的 DNA。這些基

因片段可以來于PCR 制備，也可以來于限制性內(nèi)切酶酶切法制備。

3.這些含同源基因片段（或同源基因片段的一部分）的DNA 片段總長(zhǎng)度不要超過 1 kb，同時(shí)比 DNA shuffling 終產(chǎn)物（第二輪 PCR 產(chǎn)物）長(zhǎng) 200-400 bp，因?yàn)榈诙?PCR 的引物位置在此步制備的模板 DNA 內(nèi)側(cè) 100-200 bp。

4.每次 DNA Shuffling 實(shí)驗(yàn)需要 2-5 μg 起始 DNA 片段。如果使用幾個(gè)同源基因片段，則其比例為 1:1:1，總量保證有 2-5 μg。

5.起始模板 DNA 必須通過膠回收純化，以便徹-底去除殘留的質(zhì)粒模板、引物和非特異擴(kuò)增產(chǎn)物等。如果不去除此步的引物，其將對(duì)后續(xù) PCR 造成嚴(yán)重干擾。

6.測(cè) OD260 確定模板 DNA 濃度，此溶液為同源基因 DNA 模板，放冰上待用。二：酶切和回收模板 DNA

7.準(zhǔn)備 10 μL DNase I 工作液（0.1 U/μL）。將 1 μL 本試劑盒提供的 1 U/μ

L 的 DNase I 溶液和 8 μL 超純水、1 μL DNA Shuffling 專用反應(yīng)液 A 混合得濃度為 0.1 U/μL 的 DNase 工作液，放冰上待用。此溶液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。

8.在一個(gè) PCR 管中，按順序加入下列成分：

成分用量

同源 DNA 片段（來于多個(gè)不同基因） 2-5 μg DNA Shuffling 專用反應(yīng)液 A，10×     10 μL DNA Shuffling 專用反應(yīng)液 B，10×     10 μL

DNase I 工作液（0.1 U/uL）        1 μL補(bǔ)超純水到100 μL

9.充分輕柔吹打混勻后 37℃保溫，分別 5 分鐘、6 分鐘、7 分鐘和 8 分鐘取樣

（可以根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)調(diào)整酶切時(shí)間），每次取 25 μL 到一個(gè)新的 PCR 管中，馬上放 75℃（10 min）以滅活 DNase I。

10.在 2-3%瓊脂糖凝膠或 10% PAGE 膠上電泳上步所得的 4 個(gè)樣品（每個(gè) 25

μL），根據(jù) DNA 電泳 Marker 鎖定的分子量范圍，回收 25-150 bp 范圍的

DNA 并將其溶解在超純水中，測(cè) 260 nm 得濃度，放冰上待用。

三：無引物PCR

11.在一干凈 PCR 管中加入 0.5 μg 回收片段、50 μL DNA Shuffling 專用無引物 PCR MasterMix、補(bǔ)加超純水到 100 μL。反應(yīng)總體積為 100 μL。按下面的PCR 反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行第一輪無引物 PCR：PCR 前變性 94℃150 秒，PCR 循環(huán) 40 次（94℃ 30s，47.5℃ 45s，72℃ 10 s，每次循環(huán)后增加 5s），最后 72℃ 10 分鐘。

12.PCR 結(jié)束后，取 5-10 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，然后對(duì)預(yù)期長(zhǎng)度區(qū)域的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收（如果同源區(qū)域長(zhǎng)度為 800 bp，則回收 600-1000 bp 范圍的片段）。此步將去除小片段 DNA 對(duì)下輪 PCR 的干擾。

13.預(yù)留 25%回收產(chǎn)物原液，剩余的 75%分三份，每份 25%。分別用超純水將其分別稀釋 10 倍、20 倍和 50 倍。

四：帶引物PCR

14.分別用上步的原液、10 倍稀釋液、20 倍稀釋液和 50 倍稀釋液各 1 μL 作為

PCR 模板，按下表設(shè)置 4 管帶引物PCR 反應(yīng)：

15.按下面的PCR 反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行第一輪無引物 PCR：PCR 前變性 94℃150 秒， PCR 循環(huán) 25 次（94℃ 30 s，47.5℃ 45 s，72℃ 60 s，每次循環(huán)后增加5 s），最后 72℃ 10 分鐘。

16.電泳檢測(cè) 4 個(gè) PCR 產(chǎn)物，回收預(yù)期大小的 PCR 產(chǎn)物（根據(jù)引物位置估計(jì)預(yù)

期大小），用于后續(xù)克隆和分析實(shí)驗(yàn)（略）。

選擇我們的DNA Shuffling 試劑盒，就是選擇精準(zhǔn)、高效、可靠的檢測(cè)方案，為您的科研實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航！