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產(chǎn)品簡介：

用體外轉(zhuǎn)錄方法制備的 RNA 是 RNA 藥物和 RNA 疫苗的重要原料，但研究發(fā)現(xiàn)如果在體外轉(zhuǎn)錄時用 5mCTP（5-methylcytosin-5′-triphosphate, CAS#: 327174-86-7）和 m1?TP（N1-methyl-pseudouridine-5′-triphosphate, CAS#: 1428903-59-6）分別替代 CTP 和 UTP，得到的修飾 RNA 翻譯效果提高40 多倍，免疫性也大為降低。為此本公司在常規(guī) T7 體外轉(zhuǎn)錄試劑的基礎(chǔ)上，升級開發(fā)了本產(chǎn)品。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.用 5mC-CTP 代替CTP，用 m1??UTP 代替 UTP，并且分開而不是以混合液的方式提供，方便用戶制備單一種修飾或者雙重修飾的 RNA。

2.即開即用，用戶只需提供含 T7 啟動子的 DNA 模板即可。

3.提供體外轉(zhuǎn)錄專用熒光染料，加入到體系中可以實(shí)時監(jiān)控反應(yīng)的進(jìn)行，便于優(yōu)化條件。實(shí)驗結(jié)束后不需要浪費(fèi)寶貴的樣本進(jìn)行電泳。如果擔(dān)心染料對后續(xù)實(shí)驗有影響，也可以不加。

4.模版 DNA 可以是線性化的質(zhì)粒 DNA，也可以是 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。

5.可以合成的 RNA 的最佳長度在 20nt 到 2000 nt 之間。

6.產(chǎn)品配方經(jīng)過精心優(yōu)化，1ug 質(zhì)粒DNA 模版可以在3 小時內(nèi)合成大約30 ug

修飾 RNA（具體跟模板 DNA 序列，長度，純度等相關(guān)）。

7.得到的 RNA 可以用于 RNA 結(jié)構(gòu)研究、核酶生物化學(xué)、體外翻譯、RNA-蛋白質(zhì)相互作用、反義技術(shù)、SELEX 技術(shù)和 RNA 干擾（RNAi）等實(shí)驗。

8.本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的修飾堿基體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗。

9.實(shí)時雙修飾 T7 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

成份規(guī)格包裝

2×雙修飾 T7 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液

（含 5mCTP 和m1?TP）0.5 mL0.5mL 綠蓋管

體外轉(zhuǎn)錄專用熒光染料50 μL0.5mL 棕色蓋

T7 RNA 聚合酶-RI 混合液50 μL0.5mL 紅蓋管

RNase-free 水1 mL1.5mL 藍(lán)蓋管

使用手冊1 份無

運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸，-20℃保存、有效期一年。

自備試劑

Tris 飽和酚、氯仿、RNase-free 75%乙醇(均可從本公司另購)。

使用方法：

一、制備 DNA 模板（本試劑盒不含所需試劑，此處信息僅供參考）

PCR 片段和質(zhì)粒 DNA 都可以用作體外轉(zhuǎn)錄的模板，但是必須注意以下幾點(diǎn)。

1.一是必須使用線性化的 DNA。如果是質(zhì)粒 DNA，則必須先用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切成線狀。

2.二是需要轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列的上游必須有 T7 啟動子。如果模板是 PCR 產(chǎn)物， 則可以在設(shè)計引物時將 T7 啟動子序列（5’TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3’）加上。如果是將DNA 片段克隆到載體上，則需要選擇有 T7 啟動子的載體，并且克隆位點(diǎn)必須位于 T7 啟動子下游。

3.三是需要轉(zhuǎn)錄的DNA 序列的下游端最好不要是3’突出。如果是3’突出（比如選擇了Pst I 來線性化質(zhì)粒），則最好用 T4 DNA 聚合酶修平。

4.四是必須保證 DNA 模板中沒有 RNase。由于提取質(zhì)粒 DNA 的過程中一般要使用大量的 RNase A，因此質(zhì)粒 DNA 一般都有嚴(yán)重的 RNase A 污染， 所以在用作模板前，最好采取膠回收得方法回收質(zhì)粒 DNA。并且加入少量總RNA 一起保溫，然后電泳檢測 RNA 是否被降解，以此來判斷純化的 DNA 模板是否有殘留 RNase A。如果有 RNase 污染，則必須反復(fù)酚-氯仿抽提去除殘留的 RNase，然后再乙醇沉淀質(zhì)粒 DNA。

二、體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

5.按下表設(shè)置體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：

成分樣品管陰性對照管

DNA 模板50 ng 左右的PCR

片段或 1 ug 左右的線狀質(zhì)粒

不加

2×雙修飾 T7 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液

（含 5mCTP 和m1?TP）10 μL10 μL

體外轉(zhuǎn)錄專用熒光染料1 μL1 μL

T7 RNA 聚合酶-RI 混合液1 μL1 μL

補(bǔ) RNase-free 水到20 μL20 μL

注：此為 20 μL 反應(yīng)體系的用量，對其他反應(yīng)體系，各成分的用量可以按比例增減。修飾 T7 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液已經(jīng)含有修飾核苷酸。

6.在熒光定量 PCR 上 37℃保溫 4 小時。每分鐘采集一次 SYBR 通道的熒光信號。如果沒有加體外轉(zhuǎn)錄專用熒光染料，可以不采集熒光信號。不一定要跑慢 4 個小時，可以在熒光信號到達(dá)平臺期后停止反應(yīng)

7.如果沒有加熒光染料，反應(yīng)結(jié)束后需要取 1-3 μL 電泳，此時最好用 DNA 模板做電泳對照。電泳時比陰性對照多出的條帶就是擴(kuò)增得到的 RNA（由于合成的 RNA 長度不均勻，即使長度均勻，但由于自生形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，泳動速度也不一致，所以電泳所得 RNA 條帶一般都不是清晰，而是比較彌散的電泳條帶。但由于 RNA 是單鏈，分子量比同樣長度的 DNA 小一倍，因此 RNA 一般比其雙鏈 DNA 模板電泳速度更快。

8.如需去除 DNA 模板，需要另購線狀 DNA 清除劑。最好不要實(shí)用 DNase 法。

9.再用自備的 RNA 純化試劑盒純化修飾 RNA。

10.最后用自備的單鏈 RNA 定量試劑盒測定修飾 RNA 的濃度。

11.將純化的 RNA 放-80℃保存。

選擇我們的實(shí)時雙修飾 T7 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，就是選擇精準(zhǔn)、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實(shí)驗保駕護(hù)航！