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原創(chuàng) 飛飛 賽默飛色譜與質譜中國

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史華進冉良驥

隨著多肽合成技術的不斷發(fā)展和日趨成熟以及GLP-1受體激動劑（如利拉魯肽和司美格魯肽）的走紅，肽類藥物逐步成為眾多生物藥企重點關注的研發(fā)管線之一。由于多肽分子大小介于傳統(tǒng)小分子化藥和蛋白類生物藥之間，因此具備兩者的一些特性。為指導化學合成多肽藥物藥學的研究，2月21日，國家藥監(jiān)局藥品審評中心發(fā)布《化學合成多肽藥物藥學研究技術指導原則（試行）》，其在質量研究與控制部分介紹了使用LCMS鑒別合成肽。賽默飛單桿液質在線除鹽結合解卷積功能以及完善的液相色譜產品及解決方案，可以助力肽類藥物的工藝研發(fā)及質量研究和控制工作。

寡肽定義 

寡肽一般指由2-20個氨基酸殘基通過肽鍵連接形成的生物活性肽，通常也被稱作小肽，低聚肽或者小分子活性肽。相較于小分子藥物，寡肽藥物具有更好的靶向性，而對于蛋白質和多肽，寡肽分子量更小，結構更簡單更容易滲透到目標組織。

合成肽中的雜質 

固相肽合成技術因其效率高，操作簡單等優(yōu)勢，已成為主流的肽合成技術。合成過程中難免會形成相關雜質，包括合成工藝中氨基酸丟失，插入或錯配，以及脫酰胺、氧化或異構化等降解雜質。

質譜前端在線除鹽 

液相質譜聯(lián)用（LC-MS）技術作為現(xiàn)代常見的有機化合物定性手段，已被廣泛用于合成路線中主化合物及有關雜質鑒定。雖然目前為止，TFA是主流的離子對試劑用于合成肽樣品分離，不過對于有些難分離的化合物依然需要采用磷酸鹽體系改善分離。質譜使用者都熟知，像磷酸鹽這類不揮發(fā)性鹽不能直接進入質譜，這對于直接用質譜定性方法中的有關雜質增加了難度。為了解決上述問題，二維在線除鹽技術日趨流行。一維色譜保留原不揮發(fā)性鹽體系方法，二維采用揮發(fā)性的流動相將目標物送入質譜鑒定。賽默飛雙三元液相色譜系統(tǒng)（圖1），采用獨特的雙泵設計，每個泵可作為一個單獨的運行體系，有各自獨立的比例閥和流動相體系，可同時分別控制三條流動相流路，輕松實現(xiàn)二維在線除鹽功能。

圖1：雙三元泵外觀

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雙三元二維在線除鹽方法設計 

采用雙三元二維液相色譜系統(tǒng)構建的質譜前端在線除鹽流路如圖 2 所示，質譜前端在線除鹽技術過程一般主要有三個步驟，主要利用柱溫箱上的兩個2位6通閥切換技術，控制不同流路間的聯(lián)動。實驗首先對原來含有不揮發(fā)性鹽流動相方法進行重現(xiàn)，確定待切組分的出峰時間，設定切閥時間。由圖2可見，柱溫箱上閥帶有樣品收集環(huán)，本實驗配置的樣品環(huán)為500 μL，結合一維色譜流速為1.0 mL·min?1，因此，最大的收集時間為0.5min，通過閥切換技術可以將目標組分（流動相含有不揮發(fā)性鹽或離子對試劑）收集于環(huán)中，非目標組份可直接經由閥排入廢液；然后收集好的組分會由配有質譜兼容流動相的雙三元左泵帶入在線除鹽小柱，目標組分先保留在除鹽柱上，不揮發(fā)性鹽在除鹽柱上無保留，因此直接流入廢液。最后，待鹽全部流穿后，通過下閥閥切，改變左泵梯度，將目標組分帶入質譜儀進行定性分析。

圖2 雙三元二維在線除鹽系統(tǒng)流路圖

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質譜解卷積 

多肽分子使用電噴霧離子源（ESI）時，由于其存在多個潛在電荷位點，質譜圖中會出現(xiàn)多個電荷對應的不同m/z離子信號。通過這些離子峰不能直接獲取多肽分子的準確分子量。根據(jù)多電荷離子碎片的質荷比推算單電荷多肽的分子量這一方法被稱為電荷解卷積，質譜圖通過解卷積處理后可以直接獲得多肽的準確分子量。

儀器配置 

Vanquish Core系列液相色譜儀：

雙三元泵：VC-P33-A-01；

自動進樣器：VC-A12-A-02；

柱溫箱：VC-C10-A-03（配置兩個2位6通閥，500uLloop環(huán)）；

DAD檢測器：VC-D11-A；

VWD檢測器：VC-D40-A；

ISQ單桿質譜檢測器；

變色龍色譜管理軟件 Chromeleon CDS 7.3.1配備去卷積權限PN:7200.0046

結果與分析

按一維分析柱條件運行一維色譜，可以得到一維紫外色譜圖。如圖3所示，主化合物出峰時間為35.947 min，在16.523 min處有一個雜質，為此次實驗研究雜質。通過一維色譜圖可以確定樣品環(huán)的收集時間或閥切換時間，根據(jù)一維色譜出峰時間，設定第一次切閥時間為16.3min，即一維待測組分轉入樣品環(huán)，第二次閥切時間為16.8min，即二維流動相將組分帶入除鹽柱，進行在線除鹽，然后待鹽除去后，設置下閥切閥時間并調節(jié)流動相比例，將待測物轉入質譜。

圖3 寡肽樣品一維紫外檢測器色譜圖

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因質譜不能使用不揮發(fā)性鹽流動相，為盡可能降低其進入后端質譜風險，實驗前期采用紫外檢測器研究切閥及二維色譜條件，監(jiān)測待測物是否成功切入二維。由圖4可見，按二維除鹽柱條件運行二維色譜，22分鐘前，在高比例水相條件下除去不揮發(fā)性鹽，然后26分鐘提高有機相比例，即將待測物成功轉入二維檢測器，在紫外檢測器中出鋒時間為26.94min，且峰形良好。

圖4 寡肽樣品二維紫外檢測器色譜圖

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待二維方法確認后，將質譜檢測器串聯(lián)到二維紫外檢測器后，按照色譜及質譜條件運行系統(tǒng)，如圖5所示，在質譜總離子流色譜（TIC）中，待測雜質峰出峰時間為27.0min且質譜響應較高。

圖5寡肽樣品二維質譜檢測器總離子流圖

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通過Chromeleon數(shù)據(jù)處理軟件去卷積功能，可通過去卷積算法，將系列離子峰轉化為單個分子質量。圖6中展示了軟件通過算法可以獲得離子峰對應的電荷數(shù)分布及該寡肽的分子量。

圖6 變色龍軟件去卷積處理后待測雜質質譜結果

（1）進樣序列；（2）目標組分列表；（3）去卷積參數(shù)設置；（4）和（6）總離子流圖；（5）全掃描質譜圖；（7）去卷積譜圖；（8）源質譜圖；（9）去卷積結果組成列表。（點擊查看大圖）

小結

利用雙三元二維液相儀器，一個泵模塊，可以發(fā)揮兩個泵的功能，開展在線除鹽技術，操作簡單，節(jié)省臺面空間。除鹽后，組分可以直接進入質譜檢測器，進行后續(xù)定性工作。整個過程完全自動化，可以確保實驗重現(xiàn)性，提高分析效率，節(jié)省時間。數(shù)據(jù)采集后，結合變色龍軟件質譜去卷積功能，對數(shù)據(jù)進行處理，可以快速獲取寡肽樣品有關化合物的電荷分布及分子量結果。因此，本研究可以輔助寡肽合成工藝，獲取目標峰分子量，為寡肽合成終點控制，中間體控制，雜質確證，合成路線優(yōu)化等工作提供指導意義。

參考資料：

《化學合成多肽藥物藥學研究技術指導原則（試行）》

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