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二惡英檢測(cè)方法比較（一）
二惡英化合物（簡(jiǎn)稱二惡英）是劇毒有機(jī)污染物。人體長期低劑量接觸，會(huì)導(dǎo)致癌癥、雌性化、胎兒畸形、糖尿病等疾病。自比利時(shí)發(fā)生二惡英食品污染事件和《POPs公約》在瑞典斯德哥爾摩簽署以來，二惡英檢測(cè)與污染防治在上受到越來越廣泛的關(guān)注[1]。二惡英檢測(cè)屬超痕量、多組分檢測(cè)，對(duì)特異性、選擇性和靈敏度要求*，被認(rèn)為是當(dāng)代化學(xué)分析領(lǐng)域的一大難點(diǎn)。
美國較早開展二惡英檢測(cè)研究，現(xiàn)已制定出一系列的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。歐洲和日本也相繼研究和制定了二惡英檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法。我國目前正處于二惡英基礎(chǔ)研究的起步階段，尚未提出相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和方法，因此亟待建立符合我國國情的二惡英檢測(cè)方法和體系。
2 二惡英檢測(cè)方法
2.1化學(xué)儀器分析方法
在200余種異構(gòu)體中分離出17種有明顯毒性的二惡英 ，分別測(cè)定其濃度或含量。將濃度或含量乘以每種二惡英的毒性因子（TEF）就可以得到總毒性當(dāng)量（TEQ）。該方法的一般程序包括采樣、提取、凈化、定性定量。
2.1.1 采樣
樣品的取樣量由樣品類型、污染水平和方法的檢測(cè)限而定。各國對(duì)采樣程序都單獨(dú)編制了標(biāo)準(zhǔn)方法。
2.1.2 提取
為了測(cè)定提取凈化效率和校正分析丟失，首先加入17種13C－PCDD/Fs采樣內(nèi)標(biāo)和37Cl－2,3,7,8－TCDD凈化內(nèi)標(biāo)。溶劑選擇和提取步驟取決于樣品類型和凈化方法，如在處理廢棄物焚燒飛灰時(shí)溶劑選取石油醚/甲苯/二氯甲苯，在處理脂肪樣品時(shí)溶劑選取二氯甲烷/己烷。提取步驟一般包括溶解、振蕩、混勻和萃取。索氏萃取是傳統(tǒng)的提取方法，廣泛應(yīng)用于檢測(cè)飛灰、魚、牛乳和脂肪組織樣品中的二惡英。目前，超臨界流體萃取裝置（SFE）、加壓加熱型的高速溶劑萃取裝置（ASE）和微波萃取方法也用于提取樣品中的二惡英，并有大量對(duì)比實(shí)驗(yàn)證明了這些方法的有效性[3,4]。
2.1.3 凈化
為了除去大量干擾物質(zhì)，目前大多采用色譜法進(jìn)行凈化。色譜法通常將分配處理柱和色譜柱串聯(lián)使用，包括酸或堿處理、硅膠柱、氧化鋁柱、佛羅里柱和活性炭柱的二次凈化，具體操作因樣品類型和基質(zhì)性質(zhì)而異。目前，一些實(shí)驗(yàn)室正在開發(fā)一次性多層柱（如微型氧化鋁柱）和HPLC凈化方法來簡(jiǎn)化凈化過程。凈化后要加入15種13C－PCDD/Fs定量內(nèi)標(biāo)和2個(gè)13C標(biāo)記的用于確定色譜保留時(shí)間的內(nèi)標(biāo)[5]。
2.1.4 定性定量
通常定性檢測(cè)采用2類不同極性的色譜柱。首先用非極性或弱極性固定相將氯原子取代數(shù)相同的二惡英化合物分為1組，然后用極性固定相分離其中的異構(gòu)體，zui后通過對(duì)17 種標(biāo)記的和未標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)樣品實(shí)施比較，獲取保留時(shí)間。定量檢測(cè)主要采用選擇離子監(jiān)測(cè)技術(shù)（SIM），以13C穩(wěn)定同位素為內(nèi)標(biāo)，根據(jù)測(cè)量目的用質(zhì)量校正程序校正質(zhì)譜模式、分辨率（M/∆M=10,000以上，10％谷峰）等，并儲(chǔ)存質(zhì)量校正結(jié)果。對(duì)氯不同取代程度的異構(gòu)體分別定量。儀器可選擇高分辨質(zhì)譜儀（HRMS）、四級(jí)桿低分辨質(zhì)譜儀（LRMS）。
2.2 生物學(xué)檢測(cè)方法
目前建立的生物學(xué)檢測(cè)方法均是通過對(duì) Ah受體活化程度的測(cè)定來間接表達(dá)二惡英的TEQ。
2.2.1 EROD細(xì)胞培養(yǎng)法
二惡英與Ah受體結(jié)合活化后，被Ah受體核轉(zhuǎn)位因子（ARNT）轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，活化的核內(nèi)基因是特異性DNA片段即二惡英響應(yīng)因子（DRE）。啟動(dòng)發(fā)揮毒性的基因并增加其轉(zhuǎn)錄，從而激活EROD酶的活性。所以通過測(cè)定EROD酶的活性，可以了解二惡英激活A(yù)h受體的能力，進(jìn)而獲得測(cè)試樣品中二惡英的 TEQ[6]。
2.2.2 螢光素酶方法
該方法是將螢火蟲螢光素酶作為報(bào)告基因結(jié)合到控制轉(zhuǎn)錄的DRE上，制備成質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)染H4IIE大白鼠肝癌細(xì)胞系（含Ah受體傳導(dǎo)途徑的各個(gè)部件）。以此構(gòu)成的CALUX系統(tǒng)螢光素酶誘導(dǎo)活性與二惡英 的毒性系數(shù)相對(duì)應(yīng)，zui終測(cè)定的結(jié)果也是TEQ[6]。
2.2.3 EIA酶免疫方法
該方法是根據(jù)鼠單克隆抗體DD3與二惡英結(jié)合的特點(diǎn)而建立的競(jìng)爭(zhēng)抑制酶免疫方法。使用酶競(jìng)爭(zhēng)配合物（HRP）和樣品中二惡英共同競(jìng)爭(zhēng)有限的DD3抗體的特異性結(jié)合位點(diǎn),以一系列不同濃度的 2,3,7,8－TCDD為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，作出2,3,7,8-TCDD標(biāo)樣與對(duì)應(yīng)樣品的劑量－效應(yīng)曲線，樣品中二惡英毒性強(qiáng)度以計(jì)算出的TCDD毒性等價(jià)濃度間接表示。zui終通過測(cè)定DD3與HRP螯合物的熒光強(qiáng)度來獲取二惡英的TEQ。螯合物的熒光強(qiáng)度與二惡英的TEQ成反比[7]。
2.2.4 DELFIA熒光免疫法
DELFIA（Dissociation-enhancement Lanthanide Fluoro Immunoassay）法屬于時(shí)間分辨熒光免疫分析法。該方法利用生物基因技術(shù)選擇出合適的抗原鍵合銪離子與樣品中二惡英競(jìng)爭(zhēng)單克隆抗體，待免疫反應(yīng)*后加入熒光增強(qiáng)液,使銪離子從抗原中解離下來，進(jìn)入增強(qiáng)液,形成膠束，地發(fā)出熒光。螯合物zui終用時(shí)間分辨熒光法分析，其熒光強(qiáng)度與二惡英的TEQ成反比[8]。