花生過敏原檢測試劑盒

說明書

產(chǎn)品簡介

    花生過敏原檢測試劑盒，采用夾心酶聯(lián)免疫法，用于定量檢測食品中的花生或花生碎粒。試劑盒中含有酶聯(lián)免疫檢測所需的所有試劑，包括標(biāo)準(zhǔn)品。
試劑盒足夠進行96次檢測（包括標(biāo)準(zhǔn)測定）。
定量分析需要使用微孔板酶標(biāo)儀。
樣品處理： 均質(zhì)和提取
檢測時間： 樣品制備（以10個樣品為例）..............約1小時檢測過程（孵育時間）.........................1.5小時
檢 測 限： < 2.5 ppm花生，相當(dāng)于樣品中0.00025 % 花生含量
特異性： 多克隆抗體可特異性檢測花生蛋白，包括花生過敏原Ara h1和Ara h2。
燕麥、小麥、大麥、芝麻或大豆提取物不會干擾該檢測。
與各豆類，如榛果仁、杏仁、核桃、腰果、開心果及山核桃等沒有任何交叉反應(yīng)。
與鷹嘴豆和青碗豆則會產(chǎn)生輕微的交叉反應(yīng)。
1、用途
   ，采用夾心酶聯(lián)免疫法，用于定量檢測食品中的花生或花生碎粒?；ㄉ梢宰鳛槌煞葜换蛲獠扛腥疚锒嬖诤统霈F(xiàn)于未經(jīng)加工的及經(jīng)加熱處理的食品中。
2、概要
   花生營養(yǎng)豐富，常被用作食品或飼料的原料。然而，花生卻是zui強過敏性物質(zhì)。其果粒中高達25 %的蛋白質(zhì)成分在具營養(yǎng)價值的同時也具有過敏性。其總蛋白含量的7 - 10 %由過敏性蛋白（如花生球蛋白和伴花生球蛋白）組成。強過敏性人員僅攝入毫克級別的花生便可引致過敏反應(yīng)，癥狀輕則僅為過敏性皮炎，重則因過敏性休克導(dǎo)致死亡。因為花生過敏是終身性存在的且無法*，所以對此類過敏人員而言，zui重要的便是避免攝入花生。然而對過敏病人而言zui麻煩的便是在經(jīng)過加工食品中往往隱藏著微量或少量的花生。
   為保護消費者免受花生過敏影響，人們建立了諸如火箭免疫電泳法、快速蛋白液相色譜法及酶聯(lián)免疫吸附法等檢測方法和體系，來檢測樣品中花生的存在及含量，從而增強產(chǎn)品對花生過敏者的安全性。
3、檢測原理
檢測的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。微孔板中包被有針對花生蛋白的特殊抗體。加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，其中含有的花生蛋白和特殊的抗體結(jié)合形成抗體抗原復(fù)合物。沒有結(jié)合的部分在洗滌步驟中被除去。隨后加入過氧化物酶標(biāo)記的抗體（酶連接物）?？贵w酶連接物和抗體抗原復(fù)合物結(jié)合，形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物（“三明治”夾心法）。沒有結(jié)合的酶連接物在洗滌步驟中被除去。將底物和發(fā)色劑加入孔中。酶連接物將發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)終止液后使顏色由藍色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450 nm 處測量。吸光度值與樣品中的花生濃度成正比。
4、試劑盒組份
每一個盒中的試劑足夠進行96個試驗（包括標(biāo)準(zhǔn)測定），盒中的組份如下：
1 x 96孔微孔板（12條每條8孔） 包被有花生抗體
5 x 標(biāo)準(zhǔn)品（每瓶1.3 ml）* 0 ppm零標(biāo)準(zhǔn)品，3.3 ppm，10 ppm，30 ppm，90 ppm花生提取物水溶液，即用型
1 x 酶連接物（11.5 ml）........................................................................紅色瓶蓋過氧化物酶標(biāo)記的抗體，即用型 1 x 底物（7 ml）....................................................................................綠色瓶蓋含有過氧化脲 1 x 發(fā)色劑（7 ml）.................................................................................藍色瓶蓋含有四甲基對二氨基聯(lián)苯 1 x 反應(yīng)終止液（14 ml）........................................................................黃色瓶蓋含1 N的硫酸1 x 提取緩沖液（125 ml）......................................................................白色瓶蓋 20倍濃縮液1 x 洗滌緩沖液（100 ml）......................................................................棕色瓶蓋 10倍緩沖液
*） 已考慮了在樣品處理的過程中產(chǎn)生的稀釋倍數(shù)100。
5、另需的試劑和設(shè)備
5.1. 設(shè)備：
−微孔板酶標(biāo)儀（450 nm）
−離心機 + 離心管
−振蕩器
−水浴鍋
−粉碎機，研缽，Ultra-Turrax勻漿機或者均質(zhì)器
−刻度移液管
−可調(diào)式20 μl - 200 μl 和200 - 1000 μl 微量移液器
5.2. 試劑：
−蒸餾水或去離子水
−脫脂奶粉（食品級）
6、操作者應(yīng)該注意之事項
反應(yīng)終止液含1 N硫酸（R36/38， S2-26）。
7、儲存條件
保存試劑盒于 2 - 8 °C，不要冷凍。
將不用的微孔板放進原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封儲存于2 - 8°C條件下。
無色發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
對過了有效期（見試劑盒外標(biāo)簽有效期）的試劑盒不再提供任何質(zhì)量保證。
不能交叉使用不同批號的盒中試劑。
8、試劑變質(zhì)的跡象
−發(fā)色劑在使用前顏色變藍
−標(biāo)準(zhǔn)品5的吸光度值小于0.8（E450 nm < 0.8）
9、樣品處理
以往分析的花生殘留必須去除！樣品處理應(yīng)該在充分清潔或新的玻璃器皿中進行。
同樣，粉碎機等設(shè)備必須在每次樣品處理后進行清潔，去除花生殘留。
− 5 g樣品小心粉碎，研磨并充分混合
−取其1 g樣品，加入20 ml提取緩沖液（參見10.1.，即用型提取緩沖液的溫度應(yīng)為約60 °C）
−充分混合，在60 °C條件下提取10分鐘，偶爾振蕩。
−離心：10 min / 2500 g / 盡量保持4 °C或過濾提取液（或?qū)?/span>2 ml提取液收集于一反應(yīng)容器中，在微量離心機中高速離心10分鐘）
−上清液按比例1:5（1+4）用即用型提取緩沖液（參見10.1.）稀釋（例如：100 μl樣品和400 μl提取緩沖液混合）
−取100 μl稀釋后上清液每孔進行檢測
備注：
一般來說，巧克力中花生是可以檢出的，但是在多數(shù)情況下非常困難（由于花生抗原被遮蓋導(dǎo)致回收率下降）。為避免抗原被遮蓋，建議在提取過程中加入1 g脫脂奶粉（食品級）。此方法同樣適用于冰激凌。巧克力樣品在提取前加熱融化（35 - 45 °C）并小心混合。
樣品提取物在2 - 8 °C條件下可保存5天。不用的提取物在-20 °C條件下可保存數(shù)月。
10、檢測步驟
10.1. 檢測前的準(zhǔn)備
使用之前將所有試劑回溫至室溫（20 - 25 °C）。
提取緩沖液為20倍濃縮液。在稀釋前在水浴鍋中37 °C條件下充分溶解可能出現(xiàn)的結(jié)晶并混合。然后對加熱后的濃縮液按比例1:20（1+19）用蒸餾水稀釋（例如：100 ml緩沖液濃縮液 + 1900 ml蒸餾水，或者直接加入蒸餾水至2500 ml）。稀釋后的提取緩沖液在2 - 8 °C條件下可保存約12周。
洗滌緩沖液為10倍濃縮液，在稀釋前如果存在結(jié)晶，應(yīng)在37 °C水浴鍋中加熱*溶解并混合。然后對加熱后的濃縮液按比例1:10（1+9）用蒸餾水稀釋（例如：100 ml緩沖液濃縮液 + 900 ml蒸餾水）。稀釋后的緩沖液在2 - 8 °C條件下可保存約4周。
10.2. 檢測操作
仔細洗板非常重要。避免在操作過程中微孔出現(xiàn)干燥。
1. 將足夠標(biāo)準(zhǔn)品和樣品檢測所需數(shù)量的孔條插入微孔板架，記錄下標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置。
2. 將100 μl標(biāo)準(zhǔn)品及處理好的樣品溶液加到相應(yīng)的微孔中，在室溫條件下（20 - 25 °C）孵育30分鐘。
3. 倒出孔中的液體，將微孔板架倒置在吸水紙上拍打（每輪拍打3 次）以保證*除去孔中的液體。每孔加入250 μl洗滌緩沖液（參見10.1.）洗滌微孔。上述操作重復(fù)進行兩遍。
4. 向每一個微孔中加入100 μl酶連接物溶液，在室溫條件下（20 - 25 °C）繼續(xù)孵育30分鐘。
5. 倒出孔中的液體，將微孔板架倒置在吸水紙上拍打（每輪拍打3 次）以保證*除去孔中的液體。每孔加入250 μl洗滌緩沖液（參見10.1.）洗滌微孔。上述操作重復(fù)進行兩遍。
6. 向每一個微孔中加入50 μl 底物和50 μl發(fā)色劑，充分混合后在室溫（20 - 25 °C）條件下暗處孵育30 分鐘。
7. 向每一個微孔中加入100 μl 反應(yīng)終止液，充分混合。在加入反應(yīng)終止液后30 分鐘內(nèi)于450 nm 處測量吸光度值。
11. 結(jié)果評估
使用Cubic spline功能進行結(jié)果評估。
花生樣品濃度可直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出（參見4. *）標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值已考慮了稀釋倍數(shù)100。
以下是沒有使用軟件的計算方法：
標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值和花生濃度mg/kg（ppm）的相互關(guān)系體現(xiàn)在半對數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖中。每個樣品中的花生濃度mg/kg（ppm）可以通過校正曲線上的吸光度值直接讀出。
關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)曲線請參看試劑盒中附帶的質(zhì)保證書。
如果零標(biāo)準(zhǔn)品的E450 nm較高，可認為是未充分洗滌或被污染。
如果樣品吸光度值（E450 nm）大于標(biāo)準(zhǔn)品5的吸光度值，應(yīng)繼續(xù)稀釋后再次檢測，以使稀釋后的檢測結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)曲線的可讀范圍之內(nèi)。
備注：
此檢測中使用的花生提取物中含有約10 %的蛋白質(zhì)成分。
陰性檢測結(jié)果并不能說明花生污染濃度低于檢測下限，同時樣品中還可能含有花生的其他成分如脂類。