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文獻(xiàn)分享|基于轉(zhuǎn)座酶的RNA-seq快速建庫流程，助力COVID-19檢測新思路

文獻(xiàn)精讀

文獻(xiàn)題目：RNA sequencing by direct tagmentation of RNA/DNA hybrids

中文題目：直接作用于切割RNA/DNA雜合鏈的RNA測序方法

發(fā)表時間：2020.1.27

發(fā)表期刊：PNAS

影響因子：9.58

合作單位：北京大學(xué)、清華大學(xué)

關(guān)鍵詞：RNA-Seq、Tn5轉(zhuǎn)座酶、SHERRY、ScRNA、SMART-Seq

背景簡介

RNA測序（RNA-seq）在基因表達(dá)差異分析方面的應(yīng)用來說頗為成熟，主要包括目標(biāo)RNA富集及片段化、一鏈和二鏈cDNA合成、PCR擴(kuò)增等幾個主要流程。其中二鏈cDNA的合成是獲得高質(zhì)量文庫的關(guān)鍵，但二鏈cDNA的合成需要引入額外的DNA聚合酶，可能導(dǎo)致測序的偏好性增加。

近日，北京大學(xué)的黃巖誼和謝曉亮研究團(tuán)隊聯(lián)合清華大學(xué)王建斌研究團(tuán)隊在美國《國家科學(xué)院院刊》(PNAS)發(fā)表了一篇名為“RNA sequencing by direct tagmentation of RNA/DNA hybrids”，介紹了一種新的基于Tn5轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)錄組測序快速建庫方法，不僅可以消除常規(guī)RNA-seq需要cDNA二鏈合成的繁瑣性而且極大的突破了Tn5僅在DNA上作用的限制，大大拓展了Tn5轉(zhuǎn)座酶的應(yīng)用范圍，同時或?qū)闋縿尤诵牡男滦凸跔畈《痉窝祝–OVID-19）檢測提供新思路。

文章方法及主要內(nèi)容

1.樣本處理：

1）Tn5轉(zhuǎn)座酶和Tn5 D188E突變株的制備、純化。

2）HEK293T和HeLa細(xì)胞培養(yǎng)、總RNA提取和純化mRNA。

3）單細(xì)胞制備。

2.研究內(nèi)容：

1）Tn5轉(zhuǎn)座酶通過作用于RNA/cDNA雜合鏈用于RNA-seq

Tn5、RNase H和 MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)構(gòu)比對和分子對接的結(jié)果表明Tn5能夠作用于RNA/DNA雜交雙鏈。隨后將Tn5應(yīng)用在HEK293T提取的mRNA/cDNA雜合鏈上，并進(jìn)一步PCR擴(kuò)增，片段化的RNA/cDNA雜合鏈和擴(kuò)增產(chǎn)物的大小分布顯示，擴(kuò)增后的產(chǎn)物分布比片段化的產(chǎn)物長100-150 bp左右。因此Tn5可作用于RNA/DNA雜合雙鏈同時應(yīng)用于RNA-Seq快速建庫方法。

圖1.Tn5轉(zhuǎn)座酶在RNA/DNA雜合鏈的作用

2）SHERRY應(yīng)用于一步快速RNA-seq文庫制備

Tn5轉(zhuǎn)座酶作用于RNA/DNA雜合鏈的轉(zhuǎn)錄組測序快速建庫方法，作者起名為SHERRY（Sequencing HEteRo RNA-DNA-Hybrid），SHERRY法轉(zhuǎn)錄組快速建庫流程：不同種類的RNA經(jīng)過oligo-dT引物的反轉(zhuǎn)錄后，Tn5轉(zhuǎn)座酶隨機(jī)結(jié)合在RNA/DNA雜合鏈上進(jìn)行切割；在Tagmentation之后，轉(zhuǎn)座酶會在雜合鏈兩端加上adaptor接頭，隨后進(jìn)行延伸反應(yīng)得到完整的含接頭的雙鏈DNA，后在測序引物作用下進(jìn)行之后的PCR文庫擴(kuò)增。

圖2.SHERRY轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)路線

SHERRY法轉(zhuǎn)錄組快速建庫流程和常規(guī)RNA-seq法在10 ng和200 ng的起始RNA上進(jìn)一步驗證，結(jié)果顯示起始量為10 ng的RNA，SHERRY法檢測結(jié)果更精確。在差異表達(dá)基因檢測能力方面，SHERRY法和常規(guī)RNA-seq法檢測差異基因數(shù)目和fold changes數(shù)較為一致。同時實驗發(fā)現(xiàn)scSHERRY法在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序中表現(xiàn)為更高的測序質(zhì)量和更低的偏好性。

圖3.SHERRY法在轉(zhuǎn)錄組測序的應(yīng)用

文章亮點

亮點1：Tn5轉(zhuǎn)座酶識別RNA/DNA雜交雙鏈并一步完成片段化和加接頭反應(yīng)，突破了在雙鏈DNA上應(yīng)用的限制；

亮點2：基于SHERRY的RNA-seq整體包含三個流程：RNA逆轉(zhuǎn)錄、RNA/cDNA的片段化和PCR擴(kuò)增，簡化了常規(guī)RNA-Seq建庫流程，總體耗時僅約4小時，手動操作時間少于30分鐘，同時可在一個管子中完成反應(yīng)。實現(xiàn)RNA的快速建庫，也極大的保證了測序的真實性。

亮點3：測序成本方面，SHERRY法轉(zhuǎn)錄組建庫僅為常規(guī)RNA-seq法的五分之一，大大節(jié)省實驗成本。

總結(jié)

基于Tn5轉(zhuǎn)座酶直接作用于RNA/DNA雜合鏈的片段化原理開發(fā)了一種轉(zhuǎn)錄組測序快速建庫新方法-SHERRY，進(jìn)一步拓展了Tn5轉(zhuǎn)座酶的新用途，不僅解決了常規(guī)RNA-seq過程繁瑣、耗時長和偏好性大的問題，同時成本方面也大大降低。因此，相較于傳統(tǒng)的RNA文庫制備方法，SHERRY法快速建庫有著更大的競爭力。當(dāng)前常規(guī)RNA-seq在SARS-CoV-2的鑒定、分型、溯源、診斷等方面展現(xiàn)了重要作用，但仍基于傳統(tǒng)的病原微生物宏基因組測序方法，耗時長且過程繁瑣。而基于Tn5轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)錄組測序快速建庫方法或?qū)镃OVID-19快速、精準(zhǔn)檢測帶來新的曙光。

參考文獻(xiàn)：Lin Di, Yusi Fu, Yue Sun, Jie Li, Lu Liu, Jiacheng Yao, Guanbo Wang, Yalei Wu, Kaiqin Lao, Raymond W. Lee, Genhua Zheng, Jun Xu,  View ORCID ProfileJuntaek Oh,  View ORCID ProfileDong Wang, X. Sunney Xie, Yanyi Huang, and  View ORCID ProfileJianbin Wang，RNA sequencing by direct tagmentation of RNA/DNA hybrids（2020）. PNAS,117(6):2886-2893.

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