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背景
       外泌體（Exosome）是由活細胞分泌的直徑約為30-150 nm的小囊泡，具有典型的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)；存在于細胞培養(yǎng)上清液、血清、血漿、唾液、尿液、羊水以及其它生物體液中；外泌體攜帶有多種蛋白質(zhì)、脂類、RNA等重要信息，不僅在細胞與細胞間的物質(zhì)和信息傳遞中起重要作用，更有望成為多種疾病的早期診斷標志物。

圖1：外泌體的分泌以及外泌體的組成

外泌體研究路線

翊圣外泌體分離試劑

只需簡單4步，輕松獲取外泌體

圖2：翊圣外泌體提取試劑盒分離過程

                                                     
三大質(zhì)檢驗證，符合鑒定“金標準”       

圖3：翊圣外泌體試劑盒提取外泌體質(zhì)檢方法

翊圣外泌體鑒定試劑盒
       翊圣生物針對外泌體標志蛋白CD63和TSG101檢測而研發(fā)的一款高效且方便實用的外泌體鑒定試劑盒產(chǎn)品適用于人、大鼠、小鼠外泌體的鑒定。

實驗結(jié)果：

注：P為CD63&TSG101陽性對照品，S為外泌體樣品

外泌體應(yīng)用
1、外泌體在肝癌發(fā)展、診斷和治療中的作用
      首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院李偉華等人在Molecular Cancer雜志發(fā)表的有關(guān)外泌體研究的綜述：分別介紹了1、外泌體在慢性乙型肝炎至肝細胞癌過程中的作用 2、外泌體與肝細胞癌的關(guān)系 3、外泌體在肝癌診斷和預(yù)后中的應(yīng)用 4、外泌體在肝癌治療中的應(yīng)用，對相關(guān)涉及的研究內(nèi)容進行總結(jié)以揭示外泌體在肝癌的發(fā)生，發(fā)展，診斷和治療中的重要性，為研究人員進一步闡明外泌體在肝癌中的作用機制，并促進外泌體在臨床診斷中的應(yīng)用和肝癌的治療提供參考。

圖4：外泌體在CHB轉(zhuǎn)化為HCC過程中的作用機制

引自：Li X, Li C, Zhang L, Wu M, Cao K, Jiang F, Chen D, Li N, Li W. The significance of exosomes in the development and treatment of hepatocellular carcinoma. MolCancer. 2020 Jan 4;19(1):1.

2、外泌體介導的miR-567在乳腺癌曲妥珠單抗中的關(guān)鍵作用
     2020年1月22日，鄭州大學di一附屬醫(yī)院韓明利等人在Cell death&disease雜志發(fā)表的文章提供來自乳腺癌和生物信息學分析的可公開獲得的表達譜數(shù)據(jù)被用于篩選曲妥珠單抗耐藥的潛在miRNA進行增益或缺失功能測定。結(jié)果表明，與應(yīng)答患者相比，曲妥珠單抗耐藥患者的miR-567顯著降低；與親代細胞相比，曲妥珠單抗耐藥細胞中的miR-567也下調(diào)。miR-567的過表達逆轉(zhuǎn)了化學耐藥性，而miR-567的沉默在體外和體內(nèi)均可誘導曲妥珠單抗。揭示了miR-567在抑制自噬和增加對曲妥珠單抗的化學敏感性中的基本作用，表明它可能是乳腺癌患者的有希望的治療靶點和預(yù)后指標。

圖5：外泌體介導的miR-567轉(zhuǎn)移曲妥珠單抗可逆轉(zhuǎn)耐藥性

引自：Han M, Hu J, Lu P, et al. Exosome-transmitted miR-567 reverses trastuzumab resistance by inhibiting ATG5 in breast cancer. Cell Death Dis. 2020;11(1):43. Published 2020 Jan 22.

外泌體標記檢測
一、親脂性染料 :PKH-67（green）/PKH-26（red）
       染料可以穩(wěn)定的與細胞膜脂質(zhì)區(qū)結(jié)合并發(fā)出熒光，主要用于細胞體外標記、體外細胞增殖研究以及體內(nèi)外的細胞失蹤研究。

圖6：PKH67標記外泌體被巨噬細胞吸收

引自：Wang Z, Maruyama K, Sakisaka Y, et al. Cyclic Stretch Force Induces Periodontal Ligament Cells to Secrete Exosomes That Suppress IL-1β Production Through the Inhibition of the NF-κB Signaling Pathway in Macrophages. Front Immunol. 2019;10:1310. Published 2019 Jun 20.

二、親脂性羰花青染料（carbocyanine dyes）:DiI/DiD/DiO/DiR
      DiI, DiO, DiD, DiR是一系列親脂性的熒光染料，可以用來染細胞膜和其它脂溶性生物結(jié)構(gòu)。

圖7：DiD標記的外泌體與PC12細胞孵育3H后共聚焦觀察的結(jié)果

引自：Tian T, Zhu YL, Zhou YY, Exosome uptake through clathrin-mediated endocytosis and macropinocytosis and mediating miR-21 delivery. J Biol Chem. 2014 Aug 8;289(32):22258-67

圖8：結(jié)果所示體內(nèi)靜脈注射DiR標記的外泌體，24H后進行成像效果

引自：Wiklander OP, Nordin JZ, O'Loughlin A, et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting.J Extracell Vesicles. 2015 Apr 20;4:26316.

三、滲透型的化合物標記法：CFSE/CFDA/Calcein-AM

1. CFSE：羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯，常稱為 CFSE，可被動擴散進入細胞。 這種試劑沒有顏色和熒光，直至細胞內(nèi)的酯酶去除其醋酸鹽基團，產(chǎn)生能發(fā)出明亮熒光的羧基熒光素琥珀酰亞胺酯。 琥珀酰亞胺酯與細胞內(nèi)氨基反應(yīng)，形成穩(wěn)定且能用醛固定劑固定的熒光偶聯(lián)物。

圖9：SKOV3細胞對SKOV3外泌體的攝取過程

引自：Escrevente, Cristina et al. “Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells.” BMC cancer vol. 11 108. 27 Mar. 2011,

2、Calcein-AM：Calcein-AM（本身不發(fā)熒光）被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein，從而被滯留在細胞內(nèi)并發(fā)出熒光被檢測到。

圖10：在無血小板血漿中，用Calcein-AM，鈣黃綠素紫，di-8-ANEPPS，乳黏附素和CD61-APC染色流式分析圖

引自：de Rond L, Libregts SFWM, Rikkert LG, et al. Refractive index to evaluate staining specificity of extracellular vesicles by flow cytometry. J Extracell Vesicles. 2019;8(1):1643671. Published 2019 Jul 25.

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HB20200218