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前 言
在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中，DNA聚合酶是構(gòu)建遺傳物質(zhì)的“建筑師"，但大多數(shù)聚合酶依賴模板鏈進(jìn)行精準(zhǔn)復(fù)制。而Terminal Deoxynucleotidyl Transferase（TdT，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶）卻打破了這一規(guī)則。作為DNA聚合酶第十家族（Pol X）的成員，TdT具有不依賴模板的DNA合成能力，這一特性使得它在許多領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，例如作為分子生物學(xué)工具用于基因突變和載體構(gòu)建、開(kāi)發(fā)基于TdT的生物傳感器用于疾病和金屬含量檢測(cè)、在DNA微陣列領(lǐng)域進(jìn)行基因表達(dá)分析和microRNA檢測(cè)、基于DNA的新一代信息存儲(chǔ)技術(shù)、酶法從頭合成DNA技術(shù)等。
本文將從TdT的生化特性、核心應(yīng)用場(chǎng)景展開(kāi)論述，探討末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)在分子生物學(xué)中的價(jià)值。
TdT的生化特性
無(wú)模板合成的“分子魔術(shù)師"
結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)與催化機(jī)制
TdT的催化核心由四個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，整體呈“右手"狀構(gòu)象，與DNA聚合酶β（Pol β）的同源結(jié)構(gòu)域高度相似。其活性中心包含兩個(gè)關(guān)鍵基序：ALLGW（T/S）GSR和TGGFRRG。前者通過(guò)“打開(kāi)-關(guān)閉"構(gòu)象轉(zhuǎn)變調(diào)節(jié)底物結(jié)合，后者則依賴精氨酸殘基穩(wěn)定催化反應(yīng)。雙金屬催化機(jī)制（通常為Mn2?或Co2?）是TdT的核心特征：金屬A（如Co2?）在底物結(jié)合階段暫時(shí)參與，金屬B（如Mg2?）則持續(xù)穩(wěn)定催化中心。這種機(jī)制使TdT能高效識(shí)別含至少3個(gè)堿基的引物鏈，甚至對(duì)六乙二醇修飾的短鏈也具有活性。
圖1.TdT催化的反應(yīng)
底物兼容性與反應(yīng)條件
TdT的底物譜廣泛，涵蓋單鏈DNA（ssDNA）、雙鏈DNA（dsDNA）及部分RNA分子。實(shí)驗(yàn)顯示，其對(duì)平末端DNA的催化效率顯著高于模板依賴型聚合酶，且對(duì)修飾核苷酸（如ddNTP、DIG-dUTP）具有高度兼容性。典型反應(yīng)條件為37℃、60分鐘，1個(gè)活性單位定義為在上述條件下催化1 nmol dNTP摻入DNA的酶量。值得注意的是，高濃度銨根離子、氯離子及EDTA會(huì)抑制其活性，而Co2?的添加可提升對(duì)平末端的催化效率達(dá)3倍以上。
生理功能與免疫應(yīng)答關(guān)聯(lián)
TdT作為誘變因子參與免疫球蛋白和T細(xì)胞受體蛋白基因多樣性形成，該過(guò)程發(fā)生在表達(dá)TdT的前淋巴細(xì)胞，在這些細(xì)胞里TdT隨機(jī)添加大約1-10個(gè)核苷酸到基因編碼區(qū)末端，從而增加了免疫組庫(kù)的多樣性(圖2)。值得注意的是，TdT在V(D)J重組中發(fā)揮作用需要DNA修復(fù)途徑的其他酶(如KU80和XRCC4)協(xié)助，然后被招募到V(D)J重組復(fù)合體。研究表明，敲除TdT基因的小鼠體內(nèi)TCR庫(kù)多樣性降低70%，驗(yàn)證了其在免疫應(yīng)答中的核心作用。
圖2 .TdT的生物學(xué)功能
TdT的核心應(yīng)用場(chǎng)景
從基礎(chǔ)研究到工業(yè)應(yīng)用
基因工程與載體構(gòu)建
TdT在基因工程中的經(jīng)典應(yīng)用是“同聚物加尾法"。通過(guò)在載體DNA的3'末端添加dATP或dTTP尾鏈，與互補(bǔ)的外源DNA片段退火連接，可高效構(gòu)建重組質(zhì)粒。例如，在cDNA文庫(kù)構(gòu)建中，TdT介導(dǎo)的加尾反應(yīng)使mRNA的3'末端獲得poly（A）尾鏈，從而與含poly（T）的載體特異性結(jié)合，提升克隆效率。此外，在RACE（快速擴(kuò)增cDNA末端）技術(shù)中，TdT通過(guò)添加隨機(jī)核苷酸尾鏈，為后續(xù)PCR提供引物結(jié)合位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)全長(zhǎng)cDNA的捕獲。
圖3 .使用TdT合成DNA
TUNEL技術(shù)
細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)，相關(guān)DNA內(nèi)切酶會(huì)被激活，從而切斷核小體間的DNA。在細(xì)胞凋亡晚期，DNA會(huì)被降解為180-200 bp的片段。 TdT介導(dǎo)的dUTP末端標(biāo)記法（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL）是在TdT的催化下將熒光素標(biāo)記的dUTP（fluorescein-dUTP）與斷裂DNA暴露的3'-OH聚合，延伸后的DNA可通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。臨床研究顯示，TUNEL在急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）診斷中具有特異性。ALL患者骨髓樣本的TdT陽(yáng)性率達(dá)95%，而成熟淋巴細(xì)胞呈陰性，為疾病分型和預(yù)后評(píng)估提供關(guān)鍵依據(jù)。
圖4 .TdT標(biāo)記細(xì)胞凋亡
DNA甲基化測(cè)序的“接頭工程師"
在全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序（WGBS）中，TdT通過(guò)添加同聚物尾鏈實(shí)現(xiàn)ssDNA與接頭的連接。具體流程為：
重亞硫酸鹽（Bisulfite）處理DNA，使未甲基化修飾的胞嘧啶C轉(zhuǎn)化為尿嘧啶U，變性為ssDNA。
3′接頭連接，TdT末端轉(zhuǎn)移酶參與目的DNA 3′端添加接頭的過(guò)程，催化ssDNA的3′羥基端加上同聚物尾巴（示意圖中橙色曲線部分），從而在連接酶的作用下與接頭進(jìn)行連接。
DNA二鏈合成，5′接頭連接。
PCR擴(kuò)增獲取含有完整接頭序列的上機(jī)文庫(kù)。
圖5. DNA甲基化建庫(kù)流程
酶促法DNA合成的“基石"
TdT在DNA從頭合成技術(shù)中占據(jù)核心地位?；谄浞悄０逡蕾囂匦?，研究者開(kāi)發(fā)出兩種策略：
Type I策略：將dNTP的堿基部分通過(guò)連接物（linker）與TdT共價(jià)連接，形成TdT-dNTP耦合物。耦合物催化引物DNA延伸一個(gè)堿基后，產(chǎn)物DNA仍與TdT共價(jià)結(jié)合，阻礙后續(xù)添加。通過(guò)物理、化學(xué)或生物方法切斷連接物，釋放產(chǎn)物DNA，進(jìn)入下一循環(huán)。
Type II策略：使用3'-OH端帶有可逆保護(hù)基團(tuán)的dNTP（如RTdNTPs）。TdT催化RTdNTP添加至引物DNA后，產(chǎn)物DNA因3'-端被保護(hù)而無(wú)法繼續(xù)延伸。通過(guò)脫保護(hù)步驟去除保護(hù)基團(tuán)，恢復(fù)3'-OH，進(jìn)入下一循環(huán)。
DNA微陣列技術(shù)
TdT酶（末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶）在DNA微陣列技術(shù)中主要應(yīng)用于單鏈DNA文庫(kù)構(gòu)建及探針標(biāo)記優(yōu)化，通過(guò)其非模板依賴的末端延伸特性提升雜交效率與信號(hào)強(qiáng)度，同時(shí)助力DNA序列的定向修飾，為微陣列檢測(cè)的靈敏度和特異性提供關(guān)鍵支持。
TdT作為分子生物學(xué)工具中的“非模板革命者"，其應(yīng)用已從基因工程基礎(chǔ)技術(shù)延伸至臨床診斷和合成生物學(xué)前沿。隨著酶工程改造技術(shù)的進(jìn)步，TdT的穩(wěn)定性、底物兼容性和催化效率將持續(xù)優(yōu)化，為DNA測(cè)序、疾病標(biāo)志物開(kāi)發(fā)及DNA存儲(chǔ)技術(shù)提供更強(qiáng)動(dòng)力。未來(lái)，TdT有望成為連接基礎(chǔ)研究與臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵橋梁，推動(dòng)生命科學(xué)進(jìn)入精準(zhǔn)調(diào)控的新紀(jì)元。
現(xiàn)在翌圣重磅推出具有低殘留、高純度的特點(diǎn)的TdT末端轉(zhuǎn)移酶，高效進(jìn)行DNA末端的同聚物加尾。適用于各種應(yīng)用場(chǎng)景。
性能展示
無(wú)切口酶殘留
切口酶殘留結(jié)果：跑膠結(jié)果顯示兩批次TdT末端轉(zhuǎn)移酶與陰性對(duì)照（C）一致，顯示無(wú)切口酶殘留。
無(wú)核酸外切酶殘留
核酸外切酶殘留結(jié)果：跑膠結(jié)果顯示兩批次TdT末端轉(zhuǎn)移酶與陰性對(duì)照（C）一致，顯示無(wú)核酸外切酶酶殘留。
產(chǎn)品推薦
產(chǎn)品定位 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) |
高效率TdT末端轉(zhuǎn)移酶（帶buffer） | Terminal Deoxynucleotidyl Transferase TdT末端轉(zhuǎn)移酶 | 10302ES |
低濃度高效率TdT末端轉(zhuǎn)移酶（不含buffer） | Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (20U/μL, without buffer) TdT 末端轉(zhuǎn)移酶 | 14456ES |
高濃度高效率TdT末端轉(zhuǎn)移酶（不含buffer） | Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (100 U/µL) TdT末端轉(zhuǎn)移酶 | 14453ES |
高效率連接酶 | E. coliDNA ligase (60 U/μL) | 14955ES |
DNA純化/分選磁珠 | Hieff NGS®DNA Selection Beads | 12601ES |
文庫(kù)定量試劑盒 | ssDNA HS Assay Kit | 12645ES |
甲基化建庫(kù)試劑盒 | Hieff NGS® Methyl-seq DNA library Prep kit for Illumina V2 甲基化DNA建庫(kù)試劑盒V2 | 12221ES |
細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 | TUNEL Apoptosis Detection Kit(FITC) TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(FITC) | 40306ES |
參考文獻(xiàn)：
Chengjie Zhang, et,al.Terminal deoxynucleotidyl transferase: Properties and applications,Engineering Microbiology , Volume 5, Issue 1 , 2025,100179, ISSN 2667-3703.
#Terminal Deoxynucleotidyl Transferase #TdT #末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶
