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關(guān)鍵詞：dsDNA、雙鏈DNA、dsDNA定量、熒光核酸染料、A260、DNA殘留
Picogreen dsDNA雙鏈DNA（dsDNA）定量檢測
檢測原理
Picogreen是一種極為靈敏的熒光核酸染料，常用于雙鏈DNA的定量檢測。歷來DNA濃度的測定在cDNA文庫的構(gòu)建，DNA亞克隆、PCR產(chǎn)物的估測等領(lǐng)域中具有重要意義。疫苗等生物制品中殘留微量DNA的檢測更是直接關(guān)系到人類的健康。
Picogreen僅在與DNA雙鏈結(jié)合后才發(fā)出熒光，且所產(chǎn)生的熒光與DNA濃度呈正比，在存在ssDNA、RNA和單體核苷酸的條件下，可以選擇性地檢測低至25pg/ml的dsDNA。該分析在三個數(shù)量級范圍內(nèi)呈線性，且?guī)缀鯚o序列依賴性，可以地測量多個來源的DNA，包括基因組DNA、病毒DNA、小量提取DNA或PCR擴增產(chǎn)物?？捎?/span>熒光分光光度計或熒光酶標(biāo)儀讀數(shù)，Ex/Em=480nm/520nm。
產(chǎn)品優(yōu)勢
相比傳統(tǒng)的方法，如紫外吸光法（A260）、探針雜交法、Hoechst 33258染料法等，Picogreen dsDNA Quantitation Reagent定量具有以下優(yōu)勢：
①靈敏度高：數(shù)量級較UV吸光讀數(shù)更敏感，可節(jié)省寶貴的樣品；
②特異性強：在等摩爾的RNA存在的條件下，對dsDNA具有特異性；
③耐受性好：耐受較高濃度的鹽、尿素、乙醇、氯仿、去垢劑、蛋白或瓊脂糖，可以直接定量PCR擴增產(chǎn)物而無需從反應(yīng)混合物中純化DNA。
④易于使用——只需在樣品中加入染料，等待5分鐘，然后讀數(shù)即可，且適用于96和384孔板；與大多數(shù)基于熒光的酶標(biāo)儀和熒光計兼容。
⑤適用范圍廣：可適用于PCR的分析、芯片樣品、DNA損傷分析、酶活性分析、基因組DNA定量以及復(fù)雜混合物中dsDNA的檢測和病毒DNA定量等多種領(lǐng)域。
產(chǎn)品應(yīng)用
測定微量的DNA殘留（如疫苗生產(chǎn)）；對DNA樣品進行定量
運輸和保存方法
室溫運輸。4℃避光干燥保存，有效期6個月。
檢測步驟【以雙鏈DNA定量檢測試劑盒為例】
1、2μg/ml的Calf thymus DNA standard濃縮液的配制
用1×TE對Calf thymus DNA standard (100μg/ml)進行50倍稀釋，即向30μl Calf thymus DNA standard加入1.47ml 1×TE混勻即可。
2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
① 比色皿體系檢測（2ml）
a、按照表1 向一次性微量比色皿中加入TE和2μg/ml Calf thymus DNA standard，隨后加入1ml PicoGreen定量試劑，混勻后，于室溫避光孵育2-5min，并以1×TE緩沖液為blank。【注】：確信不要在樣品中引入氣泡，輕輕地彈微量檢測皿的外部，可以驅(qū)散氣泡。
表1 比色皿體系所需加入各組分量及標(biāo)準(zhǔn)品終濃度表
TE (μl) | 2μg/ml Calf thymus DNA standard (μl) | 稀釋的PicoGreen定量試劑 (μl) | Calf thymus DNA standard終濃度 |
0 | 1000 | 1000 | 1μg/ml |
900 | 100 | 1000 | 100ng/ml |
990 | 10 | 1000 | 10ng/ml |
999 | 1 | 1000 | 1ng/ml |
1000 | 0 | 1000 | blank |
b、于熒光儀中檢測各濃度熒光值，Ex/Em=480nm/520nm。
【注】：為了確保熒光讀數(shù)在熒光儀的檢測范圍內(nèi)，應(yīng)調(diào)節(jié)增益使含zui高DNA濃度的樣品熒光值與熒光儀的zui大值一致；為了減少光漂白，應(yīng)保持所有樣品的檢測時間一致。
c、各濃度得到的熒光值減去空白對照熒光值，對DNA濃度和熒光值做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
② 微孔板體系檢測（200μl）
a、按照表2 向96孔板中加入TE和2μg/ml Calf thymus DNA standard，隨后加入100μl PicoGreen定量試劑，混勻后，于室溫避光孵育2-5min，并以1×TE緩沖液為blank?！咀ⅰ浚捍_信不要在樣品中引入氣泡，輕輕地彈微量檢測皿的外部，可以驅(qū)散氣泡。
表2酶標(biāo)板體系所需加入各組分量及標(biāo)準(zhǔn)品終濃度表
TE (μl) | 2μg/ml Calf thymus DNA standard (μl) | 稀釋的PicoGreen定量試劑 (μl) | Calf thymus DNA standard終濃度 |
0 | 100 | 100 | 1μg/ml |
90 | 10 | 100 | 100ng/ml |
99 | 1 | 100 | 10ng/ml |
99.9 | 0.1 | 100 | 1ng/ml |
100 | 0 | 100 | blank |
b、于熒光酶標(biāo)儀中檢測各濃度熒光值，Ex/Em=480nm/520nm。
【注】：為了確保熒光讀數(shù)在熒光儀的檢測范圍內(nèi)，應(yīng)調(diào)節(jié)增益使含zui高DNA濃度的樣品熒光值與熒光儀的zui大值一致；為了減少光漂白，應(yīng)保持所有樣品的檢測時間一致。
c、各濃度得到的熒光值減去空白對照熒光值，對DNA濃度和熒光值做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
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