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產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

鱟試劑（ Limulus amebocyte lysate, LAL）為鱟科動物東方鱟的血液變形細胞溶解物的冷凍干燥品，鱟試劑中含有C因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。

本試劑盒的檢測原理是：在適宜的條件下（溫度，pH值及無干擾物質(zhì)），細菌內(nèi)毒素激活C因子，引起一系列酶促反應，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的顯色基質(zhì)，使其分解為多肽和黃色的對硝基苯胺（pNA，λmax = 405 nm）。在一定時間內(nèi)，pNA的生成量與細菌內(nèi)毒素濃度成正相關(guān)，據(jù)此，可以定量供試品的內(nèi)毒素濃度。同時，對硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化試劑染成玫瑰紅色（λmax = 545 nm），避免了供試品本身的顏色對405nm處吸收峰的干擾。

按反應時間不同可檢測0.1 EU/mL-1 EU/mL 和0.01 EU/mL -0.1 EU/mL 兩個區(qū)間（反應時間T1和T2見出廠檢驗報告） 。

產(chǎn)品組分

運輸與保存方法

冰袋運輸。4 oC，避光保存，有效期2年。

需準備的材料和設備注意事項

1）該試劑盒用于體外細菌內(nèi)毒素的定量檢測，嚴禁試劑以任何途徑進入機體。
2）接觸試劑及供試品的所有器皿必須是除熱原的， 玻璃器皿可經(jīng)250℃干烤至少60 min去除熱原。試驗過程應防止微生物的污染。
3）當供試品中可能存在鱟試驗的干擾物質(zhì)時，須進行干擾試驗，參見供試品的干擾試驗。

4）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

5）本品僅用于科研用途。

無熱原試管、無熱原吸頭，濃鹽酸。漩渦混合儀、移液器、多道移液器、封口膜、試管架。恒溫水浴箱（37±1℃）、分光光度計。

供試品的貯存與預處理（若供試品為血液類，請參照我司配套血液相關(guān)處理試劑使用說明書）

1）供試品的pH值應在6-8之間，若超出此范圍，需用無熱原緩沖液、0.1 M氫氧化鈉或0.1 M鹽酸調(diào)節(jié)。

2）若供試品中可能存在鱟實驗的干擾物質(zhì)，處理參見供試品的干擾試驗。
3）若供試品中可能含有β－葡聚糖（β－葡聚糖會產(chǎn)生G因子旁路反應，干擾內(nèi)毒素檢測），需選用特異性鱟試劑。
4）若供試品為一些抗菌素如頭孢類抗菌素和磺胺制劑會對偶氮染色劑產(chǎn)生偶聯(lián)反應而干擾偶氮化顯色，需要選用不含偶氮化試劑的試劑盒（我公司提供）。

5）若供試品的本底吸光度值大于0.5，必須對供試品進行稀釋后再檢測。

6）若供試品顏色較深（例如溶血），或在酸性條件下顏色加深（例如一些組織培養(yǎng)介質(zhì)），必須設置供試品空白管以扣除供試品自身的顏色本底。供試品空白管不加入鱟試劑，以等體積鱟試劑的溶劑（該處為細菌內(nèi)毒素檢查用水）代替。其余操作同供試品管。

操作方法

1.細菌內(nèi)毒素標準溶液配制
1）溶解：取細菌內(nèi)毒素工作品1支，加入1 mL細菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水），置漩渦混勻器上混勻15 min，混勻時要防止液體濺出。

2）稀釋：將細菌內(nèi)毒素母液先用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成1 EU/mL，再稀釋成不同濃度的標準品工作液。 

A. 以10 EU/mL的內(nèi)毒素標準品和0.5、0.25、0.125、0.0625 EU/mL的梯度為例說明：

在10 EU/支的工作標準品中加入1 mL BET水，則標準品濃度為10 EU/mL。取0.2 mL 10 EU/mL的標準品，加入1.8 mL BET水， 終濃度為1.0 EU/mL。以此為母液按下表稀釋成等比例濃度梯度。配制好的內(nèi)毒素標準溶液應在4 h內(nèi)用完。

注：每步稀釋均需在漩渦混勻器上混勻30 sec。

表1 內(nèi)毒素標準溶液配制

B. 其余梯度濃度視情況而定。

2.陰性對照：為細菌內(nèi)毒素檢查用水。

3.終止劑的配置：取50 mL細菌內(nèi)毒素檢查用水，加入2 mL濃鹽酸，搖勻即可?；蛉?/span>10 mL細菌內(nèi)毒素檢查用水，加入0.4 mL濃鹽酸，搖勻即可。

4.鱟試劑、顯色基質(zhì)、偶氮化試劑等的溶解
1）鱟試劑：按標示量加細菌內(nèi)毒素檢查用水于鱟試劑中，輕輕振搖使鱟試劑*溶解，注意不要用旋渦混勻儀激烈振搖。溶解的鱟試劑應在10 min內(nèi)用完。
2）顯色基質(zhì)：按標示量加細菌內(nèi)毒素檢查用水于顯色基質(zhì)中，輕輕振搖使顯色基質(zhì)*溶解。顯色基質(zhì)溶液可在無污染的條件下于4oC貯存8 h以內(nèi)。

3）偶氮化試劑1：按標示量加反應終止劑HCl于偶氮化試劑1中；

4）偶氮化試劑2：按標示量加細菌內(nèi)毒素檢查用水于偶氮化試劑2中；

5）偶氮化試劑3：按標示量加細菌內(nèi)毒素檢查用水于偶氮化試劑3中；

6）偶氮化試劑溶液可于4oC貯存1周。

5.實驗操作

1）取無熱原試管，加入100 μL細菌內(nèi)毒素檢查用水、內(nèi)毒素標準溶液，或供試品。

2）再加入100 μL鱟試劑溶液，混勻，37oC溫育T1 min。

3）溫育結(jié)束，加入100 μL 顯色基質(zhì)溶液，混勻，37oC溫育T2 min。

4）溫育結(jié)束，加入500 μL 偶氮化試劑1溶液，混勻。

5）加入500 μL偶氮化試劑2溶液，混勻。

6）加入500 μL偶氮化試劑3溶液，混勻，靜置5 min，于545 nm波長處讀取吸光度值。(見表2)

表2 實驗操作

（上述T1及T2見該批鱟試劑的出廠檢驗報告)

數(shù)據(jù)處理

建立標準曲線：Y = b X + a，

其中Y為545 nm處吸光度值，X為內(nèi)毒素的濃度，b為直線斜率，a為Y軸截距。

當實驗數(shù)據(jù)同時滿足如下三個條件時實驗才有效：

1）標準曲線的相關(guān)系數(shù) r ≥ 0.980；

2）標準曲線低點的Y值大于陰性對照的Y值；

3）供試品平行管的平均值在標準曲線的區(qū)間內(nèi)。

供試品的干擾試驗

供試品的干擾試驗詳見《中華人民共和國藥典》2010版中《細菌內(nèi)毒素檢查法》的“光度測定法干擾試驗"。當鱟試劑、供試品的來源、配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，須進行干擾試驗。步驟如下：
1）選擇標準曲線中點或一個靠近中點的內(nèi)毒素濃度（設為λm），作為供試品干擾試驗中添加的內(nèi)毒素濃度，配制含λm內(nèi)毒素的供試品陽性對照，測量出該溶液的內(nèi)毒素濃度，稱為Cs；

2）測量出未添加外源內(nèi)毒素的供試品溶液內(nèi)毒素濃度,稱為Ct；

3）計算該試驗條件下的回收率R＝（Cs–Ct）/λm×100%

4）當R在50%～200%之間，則認為在此試驗條件下供試品溶液不存在干擾作用。
5）當R在50%～200%之外，需對供試品進行系列稀釋(稀釋倍數(shù)不得超過大有效稀釋倍數(shù)MVD)或進行其它處理消除干擾,每一稀釋溶液都重復步驟1-3，直到內(nèi)毒素的回收率R在50%～200%之間。選擇回收率R接近100%的稀釋倍數(shù)進行內(nèi)毒素檢測。

HB220223