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乳酸脫氫酶(LDH)細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品描述
 

乳酸脫氫酶(LDH)細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(LDH Cytotoxicity Assay Kit)，也稱乳酸脫氫酶檢測(cè)試劑盒(LDH Assay Kit)或乳酸脫氫酶釋放檢測(cè)試劑盒(LDH Release Assay Kit)，是一種基于Diaphorase催化INT的顯色反應(yīng)，通過比色法檢測(cè)細(xì)胞毒性時(shí)釋放的乳酸脫氫酶活性或檢測(cè)其它樣品中的乳酸脫氫酶活性的試劑盒。

檢測(cè)原理：LDH (乳酸脫氫酶）在胞漿內(nèi)含量豐富，正常時(shí)不能通過細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞受損傷或死亡時(shí)可釋放到細(xì)胞外，釋放出的LDH 在培養(yǎng)基上清中，可通過酶反應(yīng)來(lái)檢測(cè)。在乳酸脫氫酶的作用下，NAD+被還原生成NADH，NADH和INT(a tetrazolium salt)被硫辛酰胺脫氫酶(Diaphorase)催化反應(yīng)生成NAD+和紅色的甲臜(Formazan)，甲臜的量與裂解的細(xì)胞數(shù)成正比，在490 nm波長(zhǎng)下產(chǎn)生吸收峰，從而可以通過比色來(lái)定量乳酸脫氫酶的活性。吸光度與乳酸脫氫酶活性成線性正相關(guān)。

以前使用放射性的51Cr標(biāo)記細(xì)胞，隨后通過51Cr釋放進(jìn)行細(xì)胞膜完整性檢測(cè)，而LDH釋放顯然是一種更為安全有效的替代方法。本試劑盒可以用于常規(guī)的乳酸脫氫酶活性的檢測(cè)，更常用于以LDH釋放為指標(biāo)的細(xì)胞毒性檢測(cè)。同時(shí)，基于細(xì)胞總?cè)樗崦摎涿富钚缘臋z測(cè)，本試劑盒也可以用于檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)。

本試劑盒可檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞裂解液等樣品中乳酸脫氫酶的活性。一個(gè)試劑盒可進(jìn)行500次檢測(cè)。

圖 LDH檢測(cè)試劑盒原理示意圖

產(chǎn)品組分
 

保存條件
 

冰袋運(yùn)輸。-20℃保存，1年有效。其中酶溶液避免反復(fù)凍融，INT溶液(10×)需避光保存。

注意事項(xiàng)
 

1）建議樣品準(zhǔn)備好后盡量當(dāng)天完成測(cè)定。冷凍會(huì)使樣品中部分乳酸脫氫酶失活，4℃可放置2-3天。
2）由于血清含有乳酸脫氫酶，建議血清的使用濃度不要超過1%，并最好使用熱滅活血清。如果一定需要使用10%血清，在檢測(cè)時(shí)一定要設(shè)置沒有細(xì)胞，但加入了相同體積培養(yǎng)液的對(duì)照孔，以用于消除背景。

3）細(xì)胞過度生長(zhǎng)、密度過高、離心速度過大、培養(yǎng)箱內(nèi)外溫差過大，都會(huì)造成細(xì)胞釋放乳酸脫氫酶增加。

4）如果希望進(jìn)行乳酸脫氫酶活性的絕對(duì)定量，需自備乳酸脫氫酶標(biāo)準(zhǔn)品。

5）操作過程中避免氣泡的出現(xiàn)，氣泡會(huì)影響吸光值讀數(shù)。

6）吸取細(xì)胞時(shí)避免需溫和操作，力度過大會(huì)造成自發(fā)性LDH釋放，影響讀數(shù)。

7）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
8）本產(chǎn)品僅作科研用途！

使用說(shuō)明
 

1. 樣品準(zhǔn)備：

（一）LDH釋放檢測(cè)

① 根據(jù)細(xì)胞的大小和生長(zhǎng)速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使待檢測(cè)時(shí)細(xì)胞密度不超過80-90%。
② 吸去培養(yǎng)液，用PBS液洗滌一次。更換新鮮培養(yǎng)液(推薦使用含1%血清的低血清培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)臒o(wú)血清培養(yǎng)液)，將各培養(yǎng)孔分成如下幾組：無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)液孔(背景空白對(duì)照孔)，未經(jīng)藥物處理的對(duì)照細(xì)胞孔(樣品對(duì)照孔)，未經(jīng)藥物處理的用于后續(xù)裂解的細(xì)胞孔(樣品最大酶活性對(duì)照孔)，以及藥物處理的細(xì)胞孔(藥物處理樣品孔)，并做好標(biāo)記。按照實(shí)驗(yàn)需要給予適當(dāng)藥物處理(如加入0-10 μL左右特定的藥物刺激，可設(shè)置不同濃度，不同處理時(shí)間，對(duì)照孔中需加入適當(dāng)?shù)乃幬锶軇?duì)照)，繼續(xù)按常規(guī)培養(yǎng)。到預(yù)定的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)前1小時(shí)，從細(xì)胞培養(yǎng)箱里取出細(xì)胞培養(yǎng)板，在“樣品最大酶活性對(duì)照孔"中加入試劑盒提供的細(xì)胞裂解液，加入量為原有培養(yǎng)液體積的10%。加入細(xì)胞裂解液后，反復(fù)吹打數(shù)次混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。
③ 到達(dá)預(yù)定時(shí)間后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400 g離心5 min。分別取各孔的上清液120 μL，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測(cè)定。

（二）細(xì)胞內(nèi)總LDH的檢測(cè)
① 細(xì)胞毒性檢測(cè)：根據(jù)細(xì)胞的大小和生長(zhǎng)速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，使待檢測(cè)時(shí)細(xì)胞密度不超過80-90%。加入不同藥物進(jìn)行處理，并設(shè)置適當(dāng)對(duì)照。藥物刺激完畢后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400 g離心5 min。盡量吸除上清，加入150 μL用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供的細(xì)胞裂解液(10體積PBS中加入1體積細(xì)胞裂解液并混勻)，適當(dāng)搖晃培養(yǎng)板混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400 g離心5 min。分別取各孔的上清液120 μL，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測(cè)定。
② 細(xì)胞增殖檢測(cè)：根據(jù)細(xì)胞的大小和生長(zhǎng)速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，使促進(jìn)細(xì)胞增殖的藥物刺激后細(xì)胞不超過80-90%為宜。使用不同的藥物刺激細(xì)胞，并設(shè)置適當(dāng)對(duì)照。藥物刺激完畢后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5 min。盡量吸除上清，加入150 μL用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供的細(xì)胞裂解液(10體積PBS中加入1體積細(xì)胞裂解液并混勻)，適當(dāng)搖晃混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400 g離心5 min。分別取各孔上清液120 μL，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測(cè)定。

【注】：LDH釋放檢測(cè)更加常用一些，細(xì)胞內(nèi)總LDH檢測(cè)通常可以使用MTT、WST-1或CCK-8等方法替代。

2. 試劑盒的準(zhǔn)備工作：
① INT溶液(1×)的配置：根據(jù)所需的INT溶液(1×)的量，取適量INT溶液(10×)用INT稀釋液稀釋至1×。例如，取20 μL INT溶液(10×)，加入180 μL INT稀釋液，混勻后即為200 μL INT溶液(1×)。INT溶液(1×)宜現(xiàn)配現(xiàn)用，配置后4℃保存可于當(dāng)天使用，不宜配置后凍存。
② LDH檢測(cè)工作液的配制：根據(jù)待測(cè)定的樣品數(shù)(含對(duì)照)，參考下表在臨檢測(cè)前新鮮配制適量的檢測(cè)工作液?！咀ⅰ浚篖DH檢測(cè)工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，配制和使用過程中均要注意適當(dāng)避光。

③（選做）如果希望進(jìn)行LDH酶活性的絕對(duì)定量，需自備LDH標(biāo)準(zhǔn)品，并新鮮配制不同濃度LDH標(biāo)準(zhǔn)品，如10mU/mL、 5 mU/mL、2.5 mU/mL、1.25 mU/mL、0.65 mU/mL、0 mU/mL。

3. 樣品測(cè)定

① 各孔分別加入60 μL LDH檢測(cè)工作液。
② 混勻，室溫(約25℃) 避光孵育30 min(可用鋁箔包裹后置于水平搖床或側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng))。然后在490 nm處測(cè)定吸光度。使用600 nm或大于600 nm的任一波長(zhǎng)作為參考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定。

③ 計(jì)算(測(cè)得的各組吸光度均應(yīng)減去背景空白對(duì)照孔吸光度)

細(xì)胞毒性或死亡率(%)=(處理樣品吸光度－樣品對(duì)照孔吸光度) / (細(xì)胞最大酶活性的吸光度－樣品對(duì)照孔吸光度)×100

④ 可繪制細(xì)胞毒性曲線：縱座標(biāo)為實(shí)際吸光度，橫坐標(biāo)為藥物濃度；據(jù)此可計(jì)算該藥物作用特定時(shí)間的半致死劑量LD50。

【附1  LDH酶活性的相對(duì)定量】：

可同時(shí)測(cè)定一已知濃度的LDH酶標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的吸光度值，參考以下公式粗略計(jì)算出樣品中LDH酶活力：

待測(cè)樣品中LDH活力單位(mU/mL)＝(樣品孔OD490－背景空白對(duì)照孔OD490) / (標(biāo)準(zhǔn)管OD490－標(biāo)準(zhǔn)空白管OD490)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mU/mL)；根據(jù)計(jì)算結(jié)果可以比較不同樣品處理組間有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異等。
 

【附2  LDH酶活性的絕對(duì)定量】：

若需準(zhǔn)確計(jì)算出LDH酶活性的絕對(duì)活性，可通過一系列LDH標(biāo)準(zhǔn)品及相應(yīng)測(cè)得的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線相應(yīng)公式計(jì)算出樣品中LDH的酶活性。

各孔數(shù)值減去空白對(duì)照后，以檢測(cè)的吸光度(OD490)為縱坐標(biāo)，LDH酶活力(mU)為橫坐標(biāo)，繪制LDH標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)計(jì)算出該趨勢(shì)線的公式。

A490nm＝k×LDH酶活力單位(mU)＋b，通過Excel等軟件計(jì)算出趨勢(shì)線的斜率k和截距b。

根據(jù)上述公式計(jì)算樣品中LDH活力。

樣品實(shí)際吸光度(OD490)＝樣品孔OD490－背景空白對(duì)照孔OD490

檢測(cè)體系中LDH酶活力單位(mU)=(OD490-b)/k

樣品中LDH酶活力(mU/mL)＝檢測(cè)體系中LDH酶活力單位(mU )/檢測(cè)樣品體積

HB210525