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NADP/NADPH比率熒光檢測試劑盒（紅色熒光）

產(chǎn)品描述

煙|酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，輔酶Ⅰ）和煙|酰|胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP，氧化型輔酶Ⅱ）是細胞中常見的重要輔因子，通過電子交換參與各種代謝反應。NAD與一個磷酸分子以酯鍵結合形成NADP，NADP作為氧化劑參與光合作用。還原性輔酶II (NADPH)是NADP接受電子后的產(chǎn)物。NADPH作為供氫體可參與體內(nèi)多種代謝反應，如：脂肪酸和核酸的合成。

NADP/NADPH比率熒光檢測試劑盒（紅色熒光）該試劑盒適用于測定NADP和NADPH，背景低，靈敏度高。NADPH可以將探針還原為高熒光產(chǎn)物，其信號可以通過熒光酶標儀在Ex/Em = 540/590 nm或在比色測定(OD =576 nm)中定量。

產(chǎn)品組分

運輸和保存方法

冰袋運輸。避光保存于-20℃，有效期1年。

注意事項

1 熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

3 粉末溶解前請先短暫離心，以保證產(chǎn)品全在管底。

4 請勿吸入、吞咽或者直接接觸皮膚和眼睛。

5 本產(chǎn)品僅用于科研用途。

實驗過程

1 試劑準備

① NADPH標準品母液(1 mM)：將200 μL PBS (pH 7.4)加入NADPH Standard（C組分）中制備1 mM NADPH標準品母液，用時置于冰上，未用完的分裝-20°C保存，避免反復凍融。

② NADPH梯度標準液(0-10 μM)：將990 μL PBS (pH 7.4)加入到10 μL NADH標準母液(1 mM)中制備10 μM NADPH標準液，然后取200 μL的10 μM NADPH標準液按照1：3的比例用PBS (pH 7.4)稀釋成NADPH梯度標準液(3.33 μM, 1.11 μM, 0.37 μM, 0.123 μM, 0.041 μM, 0.014 μM)。

【注】：稀釋后的NADPH標準液不穩(wěn)定，應該配置后4 h內(nèi)使用。

③ NADP/NADPH反應液：向每瓶NADP/NADPH Recycling Enzyme Mix（組分A）中加入10 mL NADPH Sensor Buffer（B組分），混勻。

【注】：相當于125次測試的檢測用量，請根據(jù)實際情況進行調(diào)整。NADP/NADPH反應液在室溫下不穩(wěn)定，注意避光盡快使用。

④ NADP/NADPH Lysis Buffer（組分G）：用前恢復至室溫。

2 樣本制備

2.1 細胞樣本：收集0.5-1×107個細胞，預冷PBS潤洗后，加入100 μL NADP/NADPH Lysis Buffer（組分G），37°C孵育15 min，1500 rpm室溫離心5 min，取上清檢測。

2.2 組織樣本：取20 mg組織樣本，預冷PBS潤洗后，加入400 μL NADP/NADPH Lysis Buffer（組分G），室溫勻漿，2500 rpm室溫離心5 -10 min，取上清檢測。

2.3 細菌樣本：4°C 10,000 g離心15 min收集細菌，每107個細菌加入1 mL NADP/NADPH Lysis Buffer（組分G），室溫孵育15 min，2500 rpm室溫離心5 -10 min，取上清檢測。

2.4 植物樣本：取200 mg葉片，加入1 mL NADP/NADPH Lysis Buffer（組分G），室溫勻漿，2500 rpm室溫離心5 -10 min，取上清檢測。

【注】：建議使用新鮮樣本，如果無法及時進行檢測，樣本建議存于-80 °C，檢測時冰上解凍，但是檢測的熒光值可能會降低。不要使用RIPA裂解液，因為RIPA裂解液會干擾檢測。如果樣本中NADPH含量高，注意稀釋樣本。

3 檢測過程

3.1 如下圖，向96孔黑色平底孔板中加入25 μL的NADPH標準液、待測樣本或空白對照(PBS)。

Table 1. Layout of NADPH standards, Blank Control and test samples in a solid black 96-well microplate.

NS= NADPH Standard, BL = Blank Control, TS (Total) = Test Sample treated withNADP/NADPH Control Solution , TS (NADPH) = test sample treated with NADPH Extraction Solution, then neutralized by NADP Extraction, TS (NADP) = test sample treated with NADP Extraction Solution , then neutralized by NADPH Extraction Solution

3.2 對于NADPH提取：向待測樣本中加入25 μL NADPH Extraction Solution（組分D），室溫孵育10-15 min，再加入25 μL NADP Extraction Solution（組分E）中和。

3.3 對于NADP提取：向待測樣本中加入25 μL NADP Extraction Solution（組分E），室溫孵育10-15 min，再加入25 μL NADPH Extraction Solution（組分D）中和。

3.4 對于總NADP和NADPH：向待測樣本中加入25 μL NADP/NADPH Control Solution（組分F），室溫孵育10-15 min，再加入25 μL NADP/NADPH Control Solution（組分F）。

3.5 對于NADH標準液NS1-7：向NADPH標準液中加入25 μL NADP/NADPH Control Solution（組分F），室溫孵育10-15 min，再加入25 μL NADP/NADPH Control Solution（組分F）。

Table 2 Reagent composition for each well

3.6 每孔中加入75 μL NADP/NADPH反應液（測試總體積150 μL），混勻后，室溫避光孵育15 min-2 h。

3.7 熒光酶標儀下測量熒光讀值(Ex/Em = 540/590 nm)；也可以使用白色透明96孔板，使用酶標儀在OD=576±5nm的波長下讀數(shù)，但靈敏度低于熒光檢測。

【注】：高濃度的NADPH（終濃度>100 μM）會導致熒光讀值下降，因為NADPH sensor被過度氧化，生成非熒光產(chǎn)物。

數(shù)據(jù)分析

1 從空白標準孔獲得的讀數(shù)用作陰性對照。從其他標準的讀數(shù)中減去該值，以獲得基線校正值，熒光背景會隨時間而增加，因此標準品和測試樣本的熒光讀值計算前需減去空白孔的熒光強度值。然后，通過繪制標準讀數(shù)以獲得標準曲線和方程。

圖1 NADPH標準曲線

加入75 μL NADP/NADPH反應液后室溫避光孵育30 min后，熒光酶標儀下測量熒光讀值。

2 樣本中NADPH含量計算公式：NADPH concentration = (B/V)×D。B代表根據(jù)標曲計算出的測試樣本中NADPH的含量(μM)，V代表測試樣本體積(μL)，D代表測試樣本稀釋倍數(shù)。

3 樣本中總NADP和NADPH含量計算公式：Total concentration = (B/V)×D。B代表根據(jù)標曲計算出的測試樣本中總的NADP和NADPH的含量(μM)，V代表測試樣本體積(μL)，D代表測試樣本稀釋倍數(shù)。

4 使用總NADP和NADPH含量減去NADPH來計算NADP的量。

HB221230