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Total Superoxide Dismutase Activity Colorimetric Assay Kit II

總SOD活力檢測(cè)試劑盒II（比色法）

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase, SOD)能催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用，生成過(guò)氧化氫(H₂O₂)和氧氣(O₂)，是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶。

目前有多種SOD活性測(cè)定方法，其中NBT（氮藍(lán)四唑）法和細(xì)胞|色素|C法都是常用的檢測(cè)方法。但WST-8法更為先進(jìn)，穩(wěn)定性更好、靈敏度更高。其基本檢測(cè)原理是：

黃|嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase)催化產(chǎn)生超氧化物陰離子，該超氧化物陰離子可以與WST-8反應(yīng)產(chǎn)生水溶性的甲臜(formazan)產(chǎn)物，而SOD可以抑制上述反應(yīng)。通過(guò)分析甲臜產(chǎn)物OD值，可計(jì)算SOD的酶活力。

檢測(cè)原理圖如下：

本試劑盒可以檢測(cè)細(xì)胞或組織勻漿液上清、全血、紅細(xì)胞抽提物、血清等多種生物樣品中的SOD活性。按照試劑盒提供使用步驟操作，1個(gè)試劑盒可供100次檢測(cè)。適合用于高通量篩選研究。

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

1）WST-8反應(yīng)產(chǎn)物是穩(wěn)定的水溶性產(chǎn)物；

2）WST-8法可以通過(guò)檢測(cè)單個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光值測(cè)定SOD活力；

3）WST-8法測(cè)定時(shí)///大抑制百分率可以接近100%；

4）不受樣品中過(guò)氧化氫的干擾，本試劑盒通過(guò)添加適量過(guò)氧化氫酶等特殊方法，有效去除常規(guī)樣品中過(guò)氧化氫的干擾。

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸和保存方法

冰袋運(yùn)輸。 -20℃保存，有效期6個(gè)月。【注】：WST-8溶液需避光保存。

注意事項(xiàng)

1）待測(cè)樣品可-70℃保存一個(gè)月，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致SOD部分失活；

2）細(xì)胞或組織等樣品制備時(shí)不能采用含有Triton X-100等去垢劑的溶液，會(huì)干擾檢測(cè)；

3）抗氧化物會(huì)對(duì)本試劑盒的檢測(cè)產(chǎn)生干擾，例如0.1mM ascorbic acid，5mM GSH都會(huì)使測(cè)定出來(lái)的吸光度顯著升高。如果設(shè)置了使用說(shuō)明中的空白對(duì)照3，就可以消除樣品中的抗氧化物的干擾。

4）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用方法

1．樣品的制備

① 細(xì)胞樣品

1000-2000g，4℃離心10min收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS或生理鹽水洗滌1-2次。預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞并于冰浴進(jìn)行勻漿（可以使用玻璃勻漿器或各類(lèi)常見(jiàn)電動(dòng)勻漿器）。隨后勻漿液1500g，4℃離心5min，取上清待測(cè)。

② 組織樣品

動(dòng)物解剖前用生理鹽水（0.9% NaCl，含有0.16mg/mL肝|素|鈉）灌流*清除紅細(xì)胞及血坨，取適量的組織樣品，加入預(yù)冷的PBS于冰浴進(jìn)行勻漿（可以使用玻璃勻漿器或各類(lèi)常見(jiàn)電動(dòng)勻漿器）。隨后勻漿液1500g，4℃離心5min，取上清待測(cè)。

③ 血漿或紅細(xì)胞樣品

用抗凝管收集血液，顛倒混勻。4℃，600 g離心10min，移取上清至新的1mL離心管中，適量生理鹽水稀釋后即可作為血漿樣本進(jìn)行檢測(cè)。紅細(xì)胞樣品可以參考步驟① 細(xì)胞樣品的制備方法，或其他不含Triton X-100等去垢劑的樣品制備方法。

【注】：a. 上述樣品準(zhǔn)備完畢后可以用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Yeasen 20201）測(cè)定蛋白濃度。通常10-20µg蛋白的細(xì)胞        或組織勻漿液樣品中的SOD平均活力約1個(gè)活力單位左右(不同細(xì)胞和組織的差異會(huì)比較大，該活力范圍僅作參考)。每種樣品準(zhǔn)備20-100µg蛋白量通常已經(jīng)足夠用于后續(xù)檢測(cè)。

b. 根據(jù)蛋白濃度和預(yù)計(jì)的蛋白使用量，用本試劑盒提供的SOD檢測(cè)緩沖液適當(dāng)稀釋樣品。例如，小鼠肝臟組織10%勻漿液(組織和勻漿液的重量比為10%)上清，通常需要稀釋10-100倍。

c. 準(zhǔn)備好的樣品如果當(dāng)天測(cè)定，可以冰浴保存；如果當(dāng)天不能完成測(cè)定，于-80℃凍存可保存至少1個(gè)月。但建議盡量當(dāng)天完成測(cè)定。注意反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致SOD部分失活。

2. 試劑盒的準(zhǔn)備工作

① WST-8/酶工作液的配制

按照每個(gè)反應(yīng)160μL的體積配置適量的WST-8/酶工作液。均勻混合151μL SOD檢測(cè)緩沖液、8μL WST-8和1μL酶溶液，即可配置成160μL WST-8/酶工作液。根據(jù)待檢測(cè)樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)品）的數(shù)量，配置適量的WST-8/酶工作液。配制好的WST-8/酶工作液4℃或冰浴保存，可以在當(dāng)天使用，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。

【注】：由于酶溶液的用量較少且易沉降，必須注意在使用前先輕輕離心一下，然后適當(dāng)混勻后再使用。

② 反應(yīng)啟動(dòng)工作液的配制

把試劑盒中的反應(yīng)啟動(dòng)液(40×) 融解后混勻，按照每1μL反應(yīng)啟動(dòng)液(40×)加入39μL SOD檢測(cè)緩沖液的比例進(jìn)行稀釋?zhuān)靹蚝蠹礊榉磻?yīng)啟動(dòng)工作液。根據(jù)待檢測(cè)樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)的數(shù)量，配置適量的反應(yīng)啟動(dòng)工作液。配制好的反應(yīng)啟動(dòng)工作液4℃或冰浴保存， 可以在當(dāng)天使用，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。

③ （可選）SOD標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備

需自備SOD標(biāo)準(zhǔn)品，用本試劑盒提供的稀釋液將SOD標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至以下系列濃度：200U/mL，100U/mL，50U/mL，20U/mL，10U/mL，5U/mL，2U/mL。在隨后的檢測(cè)中可以各取20µL，參考樣品進(jìn)行檢測(cè)。

【注】：為避免稀釋后SOD酶活性的下降， SOD標(biāo)準(zhǔn)品需現(xiàn)配現(xiàn)用；本試劑盒對(duì)于SOD的檢測(cè)并不需要SOD作為標(biāo)準(zhǔn)品，但可以使用SOD標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照或作為對(duì)SOD活性定量的參考。

3. 樣品測(cè)定

① 參考下表使用96孔板設(shè)置樣品孔和各種空白對(duì)照孔。并按下表依次加入待測(cè)樣品和其它各種溶液。加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液后充分混勻。

【注】：加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液后反應(yīng)即會(huì)開(kāi)始，可以在低溫操作或用排槍操作以減小各孔間因加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液的時(shí)間先后差異而導(dǎo)致的誤差。

【*】：如果樣品有顏色或含有抗氧化物質(zhì)，則需設(shè)置空白對(duì)照3；如果樣品沒(méi)有顏色并且也不含有抗氧化物則沒(méi)有必要設(shè)置空白對(duì)照3。

② 37℃孵育30min。【注】：孵育25-35min檢測(cè)出來(lái)的SOD活力無(wú)顯著差異，但為保證檢測(cè)結(jié)果的*性，推薦孵育30min。③ 在450nm測(cè)定吸光度，如無(wú)450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片。可以使用大于650nm的波長(zhǎng)作為參考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定。

4. 樣品中總SOD活力的計(jì)算

① 抑制百分率的計(jì)算

     參考如下計(jì)算公式計(jì)算抑制百分率：

     抑制百分率＝[(A_{空白對(duì)照1}－A_{空白對(duì)照2})－(A_樣品－A_{空白對(duì)照3})]/(A_{空白對(duì)照1}－A_{空白對(duì)照2})×100%

     如果沒(méi)有設(shè)置空白對(duì)照3，則可以把計(jì)算公式簡(jiǎn)化為：

     抑制百分率＝(A_{空白對(duì)照1}－A_樣品)/(A_{空白對(duì)照1}－A_{空白對(duì)照2})×100%

    【注】：盡量使樣品的抑制百分率在30-70%范圍內(nèi)。如果計(jì)算出來(lái)的抑制百分率小于30%或大于70%，則通常需要把該樣品重新測(cè)定。如果測(cè)定出來(lái)的抑制百分率偏高，則需適當(dāng)稀釋樣品；如果測(cè)定出來(lái)的抑制百分率偏低，則需重新準(zhǔn)備濃度較高的待測(cè)樣品。

 ② SOD酶活力單位的定義：在上述黃|嘌呤氧化酶藕聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時(shí)，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個(gè)酶活力單位(unit)。

【注】：SOD活力單位的定義方式有很多種，不同的活力單位需根據(jù)其定義的不同進(jìn)行適當(dāng)換算。

 ③ SOD酶活力的計(jì)算

SOD酶活力的計(jì)算公式如下：

待測(cè)樣品中SOD酶活力單位＝檢測(cè)體系中SOD酶活力單位＝抑制百分率/(1－抑制百分率) units

例如，當(dāng)抑制百分率為50%時(shí)，待測(cè)樣品中SOD酶活力單位＝50% / (1－50%)units＝1 unit；當(dāng)抑制百分率為60%時(shí)，待測(cè)樣品中SOD酶活力單位＝60% / (1－60%)units＝1.5 units。

④ 如果樣品為細(xì)胞或組織的勻漿液，可以根據(jù)樣品的蛋白濃度和稀釋倍數(shù)，將SOD活力單位換算為U/g或U/mg蛋白。如果樣品為紅細(xì)胞抽提液，可以根據(jù)血紅蛋白含量，可換算為U/g血紅蛋白或U/mg血紅蛋白。

其他SOD檢測(cè)參考方案

1：SOD酶活力計(jì)算的參考方案：可以先使用本試劑盒繪制SOD標(biāo)準(zhǔn)品的抑制百分率曲線(xiàn)，然后根據(jù)樣品檢測(cè)到的抑制百分率對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品的抑制百分率曲線(xiàn)計(jì)算出樣品中的SOD酶活力單位。本方案僅供參考，使用本試劑盒時(shí)不必使用本方案進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)算。

此外，本方案需確保標(biāo)準(zhǔn)品的酶活力數(shù)據(jù)可靠，不會(huì)因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品的保存問(wèn)題而導(dǎo)致實(shí)際酶活力下降。

2：SOD酶活力的動(dòng)力學(xué)檢測(cè)：如果條件許可，使用本試劑盒時(shí)也可以使用動(dòng)力學(xué)方法檢測(cè)SOD的酶活力。通常在【步驟3 ① 后可以37℃孵育同時(shí)在560nm連續(xù)測(cè)定吸光度30min。根據(jù)30min內(nèi)的吸光度變化的斜率計(jì)算出抑制百分率：

抑制百分率＝[(斜率_{空白對(duì)照1}－斜率_{空白對(duì)照2})－(斜率_樣品－斜率_{空白對(duì)照3})]/(斜率_{空白對(duì)照1}－斜率_{空白對(duì)照2})×100%

其余的計(jì)算方法同上述非動(dòng)力學(xué)的計(jì)算方法。動(dòng)力學(xué)方法的檢測(cè)和計(jì)算更加精///確一些，但檢測(cè)起來(lái)相對(duì)要麻煩一些。

使用本試劑盒通常使用非動(dòng)力學(xué)方法即可。