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 Hieff NGS^® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina^®

“一步法”DNA建庫(kù)試劑盒

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Hieff NGS^® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina^®是針對(duì)Illumina^®高通量測(cè)序平臺(tái)專(zhuān)業(yè)開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)的新一代酶切法建庫(kù)試劑盒。與傳統(tǒng)的建庫(kù)法比較，本品采用高質(zhì)量的片段化酶，擺脫了繁瑣的超聲過(guò)程，同時(shí)簡(jiǎn)化了操作流程，將片段化模塊與末端修復(fù)模塊合二為一，極大的降低了建庫(kù)的時(shí)間和成本。本試劑盒具有優(yōu)xiu的文庫(kù)轉(zhuǎn)化率，可應(yīng)用于常規(guī)動(dòng)植物基因組、微生物基因組等樣本，同時(shí)能兼容FFPE DNA樣本的建庫(kù)。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，不同GC含量的樣本，均可獲得優(yōu)異的測(cè)序結(jié)果，文庫(kù)覆蓋度高，均一性好，偏好性低，使建庫(kù)變得更加簡(jiǎn)單高效。

• 適用500 pg-1 μg的基因組DNA、全長(zhǎng)cDNA等樣本
• 高質(zhì)量片段化酶，可隨機(jī)切割雙鏈DNA，酶切片段無(wú)偏好性
• 片段化、末端修復(fù)/加A一步完成
• 強(qiáng)擴(kuò)增效率的高保真酶，顯著提高文庫(kù)質(zhì)量及產(chǎn)量
• 適用于FFPE DNA樣本
• 嚴(yán)格的批次性能與穩(wěn)定性質(zhì)控

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸。所有組分-20°C保存，有效期1年。

注意事項(xiàng)

一、關(guān)于操作

1. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2. 請(qǐng)于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 配制各步驟反應(yīng)液時(shí)推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會(huì)造成文庫(kù)產(chǎn)出下降。

4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時(shí)請(qǐng)更換槍頭。

5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng)，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近。

6. PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測(cè)區(qū)進(jìn)行強(qiáng)制性的物理隔離；使用的移液器等設(shè)備；并定時(shí)對(duì)各實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進(jìn)行擦拭清理），以保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈度。

二、關(guān)于DNA///片段化

1. 本試劑盒兼容范圍為500 pg – 1 μg Input DNA。應(yīng)盡可能使用A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.0的高質(zhì)量Input DNA。

2. 若Input DNA中引入高濃度金屬離子螯合劑或其他鹽，可能會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，建議將DNA稀釋在ddH₂O或不含EDTA的10 mM Tris Buffer (pH 7.5-8.0)中進(jìn)行片段化。

3. 對(duì)于常規(guī)的高質(zhì)量基因組DNA，酶切時(shí)間參考表5，本試劑盒片段化偏好低，耐受各種GC含量的模板。對(duì)于不同降解程度的FFPE樣本，酶切時(shí)間參考表6。以上為推薦時(shí)間，需客戶在自己的實(shí)驗(yàn)體系中進(jìn)行微調(diào)，以達(dá)到*效果。

4.為保證優(yōu)質(zhì)精確的片段化效果，片段化反應(yīng)配制過(guò)程請(qǐng)于冰上操作。

5. 針對(duì)FFPE DNA建庫(kù)，若樣本質(zhì)量不佳，客戶對(duì)當(dāng)前建庫(kù)產(chǎn)量不滿意，可選購(gòu)我公司的FFPE DNA Repair Reagent (Cat#12606)對(duì)FFPE DNA進(jìn)行修復(fù)，具體使用方法可參考此產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。該試劑可與片段化末修加A過(guò)程同時(shí)進(jìn)行，無(wú)需額外的操作。

三、關(guān)于接頭連接（Adapter Ligation）

1. 針對(duì)Illumina^®測(cè)序平臺(tái)，Yeasen提供48種Barcoded Adapters: Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 4（Cat#12615~Cat#12618）；單端 96種 Index Primers: Hieff NGS^® 96 Single Index Primers Kit for Illumina^® , Set 1~Set 2 （Cat#12611~Cat#12612）；雙端 384 種 Index Primers: Hieff NGS^® 384 Dual Index Primers Kit for Illumina^® , Set 1~Set 2 （Cat#12613~Cat#12614）。

2. Adapter的質(zhì)量和使用濃度直接影響連接效率及文庫(kù)產(chǎn)量。Adapter用量過(guò)高可能會(huì)產(chǎn)生較多Adapter Dimer；用量較低可能會(huì)影響連接效率及文庫(kù)產(chǎn)量。表1列舉了使用本試劑盒，不同Input DNA量推薦的Adapter使用量。

表1  500 pg-1 μg Input DNA推薦的Adapter使用濃度

【注】：Input DNA摩爾數(shù)（pmol）≈ Input DNA質(zhì)量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均長(zhǎng)度（bp）]。

四、關(guān)于磁珠純化與分選（Bead-based Clean Up and Size Selection）

1. DNA///片段長(zhǎng)度分選步驟可選擇在末端修復(fù)/dA尾添加之前，或接頭連接后，或文庫(kù)擴(kuò)增后進(jìn)行。

2. 當(dāng)Input DNA質(zhì)量≥50 ng，您可選擇在接頭連接后分選；如Input DNA質(zhì)量<50 ng，建議您在文庫(kù)擴(kuò)增后進(jìn)行分選。

3. Ligation Enhancer中包含高濃度的PEG，會(huì)對(duì)雙輪分選產(chǎn)生顯著影響。因此，如在接頭連接后進(jìn)行長(zhǎng)度分選，必須先進(jìn)行純化步驟，再進(jìn)行雙輪分選步驟；如在末端修復(fù)/dA尾添加之前或文庫(kù)擴(kuò)增后進(jìn)行長(zhǎng)度分選，可直接進(jìn)行雙輪磁珠分選步驟。

4. 磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫，否則會(huì)導(dǎo)致得率下降、分選效果不佳。

5. 磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

6. 轉(zhuǎn)移上清時(shí)，請(qǐng)勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫(kù)質(zhì)量。

7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

8. 進(jìn)行長(zhǎng)度分選時(shí)，初始樣品體積應(yīng)盡量≥100 μL，不足時(shí)請(qǐng)用超純水補(bǔ)齊。以防因樣品體積太小導(dǎo)致移液誤差增大。

9. 產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無(wú)水乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)反應(yīng)；過(guò)分干燥又會(huì)導(dǎo)致磁珠開(kāi)裂進(jìn)而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

10. DNA純化或長(zhǎng)度分選產(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫，產(chǎn)物可于4°C可保存1-2周，-20°C可保存1個(gè)月。

五、關(guān)于文庫(kù)擴(kuò)增（Library Amplification）

文庫(kù)擴(kuò)增步驟需要嚴(yán)格控制擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。循環(huán)數(shù)不足，將導(dǎo)致文庫(kù)產(chǎn)量低；循環(huán)數(shù)過(guò)多，又將導(dǎo)致文庫(kù)偏好性增加、重復(fù)度增加、嵌合產(chǎn)物增加、擴(kuò)增突變積累等多種不良后果。表2列舉了使用本試劑盒，獲得1 μg文庫(kù)的推薦循環(huán)數(shù)。

表2  500 pg-1 μg Input DNA獲得1 μg產(chǎn)物擴(kuò)增循環(huán)數(shù)推薦表

【注】：**如果使用了不完整的接頭，需要擴(kuò)增1-3個(gè)循環(huán)，形成完整的接頭。建庫(kù)過(guò)程中若進(jìn)行片段分選，擴(kuò)增時(shí)請(qǐng)參照較高循環(huán)數(shù)擴(kuò)增。

六、關(guān)于文庫(kù)質(zhì)檢（Library Quality Analysis）

1. 通常情況下，構(gòu)建好的文庫(kù)可通過(guò)長(zhǎng)度分布檢測(cè)和濃度檢測(cè)來(lái)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

2. 文庫(kù)濃度檢測(cè)可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR定量的方法。

3. 文庫(kù)濃度檢測(cè)不可使用：基于光譜檢測(cè)的方法，如NanoDrop^®等。

4. 推薦使用qPCR方法進(jìn)行文庫(kù)濃度檢測(cè)：Qubit^®、PicoGreen^®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測(cè)定方法時(shí)，無(wú)法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物以及其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)物；qPCR定量基于PCR擴(kuò)增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫(kù)（即可測(cè)序的文庫(kù)），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測(cè)序文庫(kù)干擾。

5. 文庫(kù)長(zhǎng)度分布檢測(cè)，可通過(guò)Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細(xì)管電泳或微控流原理的設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。

使用方法

一、自備材料

1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS^® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產(chǎn)品。

2. DNA質(zhì)控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效產(chǎn)品。

3. DNA Adapter：Yeasen提供48種Barcoded Adapters: Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 4（Cat#12615~Cat#12618）；單端 96種 Index Primers: Hieff NGS^® 96 Single Index Primers Kit for Illumina^® , Set 1~Set 2 （Cat#12611~Cat#12612）；雙端 384 種 Index Primers: Hieff NGS^® 384 Dual Index Primers Kit for Illumina^® , Set 1~Set 2 （Cat#12613~Cat#12614）?；蚱渌刃Мa(chǎn)品。

4. 其他材料：無(wú)水乙醇、滅菌超純水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR儀等。

二、操作流程

圖1 OnePot DNA建庫(kù)試劑盒操作流程

三、操作步驟

3.1 DNA///片段化/末端修復(fù)/dA尾添加（DNA Fragment/End Preparation/dA-Tailing）

該步驟將基因組DNA///片段化，同時(shí)進(jìn)行末端修復(fù)及dA尾添加。

1. 將表3中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于冰上配制表3反應(yīng)體系。

表3  DNA///片段化/末端修復(fù)/dA尾添加 PCR反應(yīng)體系

3. 使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底。

4. 將上述PCR管置于PCR儀，設(shè)置表4所示反應(yīng)程序，進(jìn)行DNA///片段化，末端修復(fù)及dA尾添加反應(yīng)。

表4  DNA///片段化/末端修復(fù)/dA尾添加 PCR反應(yīng)程序

【注】：*DNA///片段化過(guò)程為有效控制片段化效果，避免過(guò)度酶切，反應(yīng)程序可預(yù)先設(shè)置4°C，待模塊溫度降至4°C時(shí)，將PCR管放入PCR儀即可。**對(duì)于完整的基因組DNA，酶切時(shí)間參考表5；對(duì)于質(zhì)量不一的FFPE DNA樣本，酶切時(shí)間參考表6。

表5  常規(guī)基因組DNA///片段化時(shí)間選擇表                            表6  FFPE DNA///片段化時(shí)間選擇表

【注】：*DIN為DNA Integrity Number，是用Agilent 2200來(lái)定義FFPE DNA降解程度的一種方法，詳見(jiàn)圖2。

圖2  Agilent 2200定義不同降解程度樣本的DIN值

3.2 接頭連接（Adapter Ligation）

該步驟將3.1步驟的產(chǎn)物末端，連接特定的Illumina^®接頭。

1. 根據(jù)Input DNA量按表1稀釋Adapter至合適濃度。

2. 將表7中各試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

3. 于3.1步驟PCR管中配制表7所示反應(yīng)體系。

表7  Adapter Ligation PCR體系

【注】：*Ligation Enhancer比較粘稠，請(qǐng)上下顛倒、振蕩，充分混勻并瞬時(shí)離心后使用。

**本公司接頭濃度與常規(guī)商業(yè)化試劑盒一致，皆為15 μM。

【接頭添加計(jì)算舉例】：當(dāng)Input DNA為100 ng，Input DNA長(zhǎng)度為300 bp時(shí)，接頭應(yīng)該添加多少？

第—步：計(jì)算Input DNA摩爾數(shù)。公式：Input DNA摩爾數(shù)（pmol）≈ Input DNA質(zhì)量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均長(zhǎng)度（bp）]；

Input DNA摩爾數(shù)（pmol）=100÷（0.66×300）=0.5 pmol；

第二步：計(jì)算接頭添加摩爾數(shù)。根據(jù)注意事項(xiàng)三表1查詢(xún)接頭添加比例；

根據(jù)表1，查得Input DNA 100 ng時(shí)接頭添加比例100:1，則接頭添加摩爾數(shù)=100×0.5 pmol=50 pmol；

第三步：計(jì)算接頭添加體積。接頭濃度=15 μmol/L（如使用其他接頭，濃度需要依據(jù)其他接頭濃度參數(shù)）；

接頭添加體積=接頭添加摩爾數(shù)（50 pmol）÷接頭濃度（15 μmol/L）=3.34 μL（注：15 μmol/L=15 pmol/μL）

綜上，接頭可添加3.4 μL，加1.6 μL水補(bǔ)齊至5 μL。（注：接頭大加入體積不超過(guò)5 μL）。

4. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

5. 將PCR管置于PCR儀中，設(shè)置表8所示反應(yīng)程序，進(jìn)行接頭連接反應(yīng)。

表8  Adapter Ligation PCR反應(yīng)程序

【注】：當(dāng)Input DNA量較低，實(shí)驗(yàn)效果不理想時(shí)，可嘗試將連接時(shí)間延長(zhǎng)一倍。

3.3 連接產(chǎn)物磁珠純化（Post Ligation Clean Up）

該步驟使用磁珠對(duì)3.2步驟的產(chǎn)物進(jìn)行純化或分選。純化可除去未連接的Adapter或Adapter Dimer等無(wú)效產(chǎn)物。

3.3.1 純化操作步驟：

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取60 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.6×，Beads:DNA=0.6:1）至Adapter Ligation產(chǎn)物中，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復(fù)步驟5，總計(jì)漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開(kāi)蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過(guò)5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，進(jìn)行洗脫：

1）如產(chǎn)物無(wú)需進(jìn)行片段分選，直接加入21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min?！咀ⅲ喝缂兓a(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫】。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，切勿觸碰磁珠。

2）如產(chǎn)物需進(jìn)行雙輪分選，加入102 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min?！咀ⅲ喝缂兓a(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫】。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，切勿觸碰磁珠。

3.3.2 雙輪分選操作步驟：

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡約30 min。配制80%乙醇。

2. 請(qǐng)渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證混勻。

3. 根據(jù)DNA///片段長(zhǎng)度要求，參考表9向上述100 μL DNA上清中加入第—輪分選磁珠，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻。

表9  磁珠文庫(kù)分選推薦比例

【注】：表中“×”表示樣品DNA體積。如文庫(kù)插入片段長(zhǎng)度為250 bp，樣品DNA體積為100 μL，則第—輪分選磁珠使用體積為0.70×100 μL=70 μL；第二輪分選磁珠使用體積為0.20×100 μL=20 μL；表中所推薦比例是針對(duì)于Adapter Ligated Insert DNA（Post Ligation），如果用戶在接頭連接前進(jìn)行分選，請(qǐng)采用Hieff NGS^® DNA Selection Beads（Cat#12601）說(shuō)明書(shū)中推薦的比例。

4. 室溫孵育5 min。

5. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移上清到干凈的離心管中。

6. 參考表7向上清中加入第二輪分選磁珠。

7. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置5 min。

8. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

9. 保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，小心移除上清。

10. 重復(fù)步驟9。

11. 保持PCR管始終處于磁力架中，開(kāi)蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約5 min）。

12. 將PCR管從磁力架中取出，加入適量21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置5 min。

13. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移20 μL上清至干凈的管中。

3.4 文庫(kù)擴(kuò)增（Library Amplification）

該步驟將對(duì)純化或長(zhǎng)度分選后的接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集。

1. 將表10中試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無(wú)菌PCR管中配制表10所示反應(yīng)體系。

表10  PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

4. 將PCR管置于PCR儀中，設(shè)置表11所示反應(yīng)程序，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表11  PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序

3.5 擴(kuò)增產(chǎn)物磁珠純化或分選（Post Amplification Clean Up/Size Selection）

同3.3.1步驟中純化操作步驟。使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）純化文庫(kù)擴(kuò)增產(chǎn)物。

如需分選，操作方法同3.3.2雙輪分選步驟。

3.6 文庫(kù)質(zhì)量控制

通常情況下，構(gòu)建好的文庫(kù)可通過(guò)濃度檢測(cè)和長(zhǎng)度分布檢測(cè)來(lái)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，具體請(qǐng)參見(jiàn)注意事項(xiàng)六。

3.7 參考實(shí)例

使用Hieff NGS^® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina^®對(duì)小牛胸腺gDNA樣本進(jìn)行酶切建庫(kù)檢測(cè)，片段化結(jié)果見(jiàn)圖3，建庫(kù)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3  OnePot DNA建庫(kù)試劑盒酶切800 ng小牛胸腺gDNA樣本（不同酶切時(shí)間片段化效果檢測(cè)）

圖4  使用本試劑盒進(jìn)行human gDNA樣本建庫(kù)，文庫(kù)進(jìn)行電泳檢測(cè)

（Input DNA為500 ng，酶切20 min，擴(kuò)增5 cycles）

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