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產(chǎn)品簡介

Hifair® Advanced One Step RT-qPCR SYBR Green Kit是一款基于SYBR Green I染料進行熒光定量的試劑盒。使用基因特異性引物，反轉錄和qPCR反應在一管內(nèi)完成，無需反復的開蓋和移液操作，大大提高了檢測效率，并降低了污染的風險。對于RNA樣本，試劑盒采用耐熱Hifair® V Reverse Transcriptase高效合成cDNA，同時采用UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase進行定量擴增。在優(yōu)化的緩沖體系下，該試劑盒的檢測靈敏度針對高表達的靶標, 可以檢至0.1 pg，中等表達的靶標，可以檢至1 pg。該試劑盒同時也適用于DNA樣本的擴增定量。該試劑盒可實現(xiàn)不同動植物樣本、細胞、微生物核酸的高靈敏檢測和定量。

產(chǎn)品信息

組分信息

儲存條件

-25~-15℃避光儲存，有效期1年。

使用說明

1. 推薦反應體系

表1反應體系*****

** 通常引物終濃度為0.2 μM，也可根據(jù)情況在0.1-1 μM之間進行調(diào)整。

*** 該試劑靈敏度，Total RNA在1 pg – 1 μg，人源樣本測試顯示最佳投入量為1 pg – 100 ng，控制Ct值整體在15-30之間為宜。

**** 推薦使用20 μL或 50 μL，以保證目的基因擴增的有效性和重復性。

***** 請于超凈工作臺內(nèi)配制，并使用無核酸酶殘留的槍頭、反應管；推薦使用帶濾芯的槍頭。避免交叉污染和氣溶膠污染。

2. 反應程序

表2 標準擴增程序

* 反轉錄溫度可根據(jù)實驗需求在50-55℃之間進行選擇。對于DNA樣本，反轉錄過程可省去。

** 特殊情況下退火/延伸溫度可根據(jù)引物Tm值進行調(diào)整，建議使用60℃。

3. 適用機型

不需要Rox校正的儀器型號：

Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler2.0, Lightcycler 96;

Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR;

Low Rox適用機型： ABI 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio 6, 7, 12k Flex;

Stratagene MX3000P, MX3005P, MX4000P;

High Rox適用機型： ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne, StepOne Plus.

4. 引物設計技巧

1）引物最好應設計成跨越一個外顯子-外顯子連接，其中一條擴增引物可以潛在地跨越實際外顯子-內(nèi)含子邊界。這種設計可以減少從污染的基因組DNA中擴增到假陽性的風險。

2）引物應具有特異性。引物設計完成以后，應對其進行BLAST檢測。

3）引物長度一般在18~27 bp，不應過長否則導致其延伸溫度過高，不適于Taq DNA 聚合酶反應。

4）引物GC含量在40%~60%，GC含量過高或過低都不利于反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于Tm值5~10℃?？砂垂絋m= 4（G+C）+2（A+T）估算引物的Tm值，也可以通過軟件計算引物Tm值。

5）PCR產(chǎn)物的長度通?？刂圃?0-300 bp,為了保證擴增效率，在設計引物時要考慮PCR產(chǎn)物的長度。

6）引物3′端末端盡量避免為A，引物3′端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3′端最好選擇T。

7）堿基要隨機分布，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在GC富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。

8）引物自身及引物之間避免存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結構使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3′ 端的互補重疊以防止引物二聚體的形成。引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。引物二聚體及發(fā)夾結構如果不可避免的話，應盡量使其DG值不要過高（應小于4.5 kcal/mol）。否則易導致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行。

5. 異常結果分析

1. 無Ct值出現(xiàn)

1. 采集熒光信號的步驟有誤：在退火/延伸結束采集信號；

2. 引物降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性；

3. 模板量不足：對未知濃度的樣品應從原液開始測試；

4. 模板降解：避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況。

2. Ct值偏大 (Ct >35)

1. 擴增效率低：反應條件不夠優(yōu)化，引物設計存在問題，可試用三步法進行反應，也可適當降低退火溫度等；

2. PCR產(chǎn)物太長：一般采用80-150bp的產(chǎn)物長度。

3)  標準曲線線性關系不佳

a.  加樣存在誤差：使得標準品不呈梯度；RNA模板推薦使用1×TE緩沖液（Cat #60143ES）進行梯度稀釋，DNA模板推薦使用ddH2O稀釋;

b.  標準品出現(xiàn)降解：應避免標準品反復凍融，或重新制備并稀釋標準品；

c.  引物設計不佳：重新設計引物；

d.  模板中存在抑制物，或模板濃度過高。

4)  NTC有擴增（Ct<32）

a.  引物設計不夠優(yōu)化：應避免引物二聚體和發(fā)夾結構的出現(xiàn)；

b.  引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比；

c.  氣溶膠污染：擴增產(chǎn)物泄露很容易在實驗室中引發(fā)氣溶膠污染，一旦污染，定量檢測結果就會不準確。推薦使用DNA/RNA Remover 核酸氣溶膠污染清除劑（Cat #19702ES）。

注意事項

1. 本產(chǎn)品僅作科研用途。

2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。

3. 加樣和配液步驟都盡量在冰上操作。

4. 每個組分在使用前都應震蕩混勻，低速離心。