產(chǎn)品簡介  

Hieff NGS® In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina® V2 是針對Illumina®高通量測序平臺研發(fā)的用于CUT&Tag實驗的文庫構建試劑盒，適用于100-100,000個細胞起始量的樣本建庫。CUT&Tag是研究蛋白與DNA互作的技術，相較于傳統(tǒng)的ChIP-seq、CUT&RUN，該技術具有文庫構建時長更短（僅需7小時）、操作更簡單、對起始樣本要求更低、抗體投入量更少、文庫產(chǎn)量更高等優(yōu)點。經(jīng)過細胞捕獲、一抗孵育、二抗孵育、轉座酶孵育、轉座酶激活、摻入DNA標準品、細胞裂解、磁珠回收gDNA、文庫擴增和磁珠分選等步驟，靶蛋白結合的DNA片段最終轉化為適用于Illumina®平臺測序的文庫。

本試劑盒包含兩個獨立模塊：BOX-I和BOX-II。BOX-I包含結合細胞的ConA Beads、提取DNA 的DNA Extract Beads以及文庫純化的DNA Selection Beads，BOX-II包含細胞透化劑、抗體結合buffer、轉座酶結合buffer、蛋白酶K以及后續(xù)文庫擴增所需的所有試劑。此外，本試劑盒已在不同種類細胞（如293T、K562、CHO、ESC細胞等）中進行了驗證，均具有良好的建庫效率和建庫產(chǎn)量。本試劑盒提供的所有試劑都經(jīng)過嚴格的質量控制和功能驗證，大程度上保證了文庫的穩(wěn)定性和重復性。

產(chǎn)品信息

組分信息

注意：*本試劑盒中包含的二抗為山羊抗兔二抗，適用于使用一抗來源于兔源的研究，若需要一抗來源于鼠源的研究，需客戶自行準備抗鼠二抗（Yeasen cat#34851ES）或其他等效產(chǎn)品。

**測序時 Index 序列 填寫時，測序平臺為NovaSeq 6000 v1.0 reagents, MiSeq, HiSeq 2000/2500，則N501-CTCTCTAT，N701-TAAGGCGA。測序平臺為NovaSeq 6000 v1.5 reagents，MiniSeq, NextSeq,HiSeq 3000/4000，則N501-ATAGAGAG，N701-TAAGGCGA。

***本試劑盒在實驗前需自備蛋白酶抑制劑Cocktail（Yeasen Cat#20123ES）或其他等效產(chǎn)品。

儲存條件

BOX-I：2-8℃保存，BOX-II：-25~-15℃保存，有效期1年。

注意事項

• 關于操作

1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應，使用前應預熱PCR儀至反應溫度附近。

4. PCR產(chǎn)物因操作不當極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進而影響實驗結果準確性。推薦將PCR反應體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測區(qū)進行強制性的物理隔離、配備文庫構建專用移液器等設備以及定時對各實驗區(qū)域進行清潔（推薦使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除噴霧），以保證實驗環(huán)境的潔凈度。

5. 操作細胞應盡量輕柔以保持細胞活性。

6. 本產(chǎn)品僅用作科研用途！

• 應用范圍

本試劑盒適用于細胞投入量為100-100,000個的CUT&Tag研究。原則上，所有真核生物的新鮮樣本或凍存樣本都能適用于本試劑盒，但不同的樣本類型需要進行不同的樣本前處理（如組織樣本的單細胞懸液制備、植物樣本或者真菌樣本的原生質體制備或細胞核懸液制備）后才能按照本實驗操作流程進行實驗。

• ConA beads操作注意事項

1. 使用前將磁珠平衡至室溫，請勿將磁珠置于0℃以下存放。

2. ConA beads與細胞結合后，應避免劇烈震蕩或用力吹打磁珠-細胞復合物使細胞應力損傷導致磁珠與細胞分離。

3. 在處理磁珠溶液時應盡量避免高轉速離心或長時間置于磁力架上，人為造成磁珠凝集。

4. 避免磁珠長時間暴露在空氣中使得磁珠干裂或者磁珠-細胞復合物損傷（不超過3 min）。

5. 孵育過程中出現(xiàn)部分磁珠沾壁/聚集是正?，F(xiàn)象，只有保證磁珠-細胞復合物處于溶液浸潤的范圍內，不會影響后續(xù)的實驗結果。

6. 本產(chǎn)品僅用作科研用途!

• 關于DNA Extract Beads及DNA Selection Beads操作注意事項

1. DNA Extract Beads用于轉座反應后的基因組DNA 提取，DNA Selection Beads在文庫純化過程中使用，切勿弄錯。

2. 磁珠使用前應先平衡至室溫，否則會導致得率下降、分選效果不佳。

3. 請勿將磁珠置于0℃以下存放。

4. 磁珠每次使用前都應充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

5. 轉移上清時，請勿吸取到磁珠，即使槍頭吸取微量磁珠都將影響后續(xù)文庫質量。

6. 磁珠洗滌使用的80%乙醇應現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

7. 產(chǎn)物洗脫前應將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續(xù)反應；過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3 min足以讓磁珠充分干燥。

8. DNA純化或長度分選產(chǎn)物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脫，產(chǎn)物于4°C可保存2天，-20°C可保存1個月。

• 關于試劑

1. 不同的Buffer試劑應注意保存條件，避免失效。

2. Digitonin有細胞毒性，且容易降解。在溶液配制過程中請做好個人防護。加入Digitonin的溶液應現(xiàn)配現(xiàn)用，在4℃放置不超過2天。

• 文庫結構

Index 2 (i5)

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACIIIIIIIITCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-NNNNNN-CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACIIIIIIIIATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’

                  Index 1 (i7)

IIIIIIII: Index 2 (i5), 8 bases；IIIIIIII: Index 1 (i7), 8 bases；-NNNNNN-: 插入序列。

• 關于抗體選擇

1. CUT&Tag實驗中使用的一抗，建議使用ChIP級別或者CUT&Tag、CUT&RUN實驗驗證過的抗體，若無法達到抗體要求級別，可以使用IF級別抗體進行實驗嘗試。

2. 實驗中建議設置陽性對照和陰性對照組，陽性對照推薦使用樣本中表達豐度較高的組蛋白，陰性對照推薦使用不加入一抗但正常加入二抗和轉座子，用于判斷整個實驗過程中是否存在異常，加入非特異性IgG的陰性對照不是必須的，在測序分析中并未提供有價值的信息，可以根據(jù)實驗需要，自行選擇是否添加。

3. CUT&Tag實驗中使用的二抗，建議根據(jù)一抗種屬以及Protein A/G的親和能力選擇無任何標記或修飾（HRP、FITC等）的二抗，二抗種屬來源以及與Protein A/G的親和能力進行選擇，可以參照以下表格：

【注】：+++++代表親和能力非常強，+++代表親和能力中等，+代表親合能力很弱，-代表沒有親合能力。

二抗推薦：Guinea Pig anti-Rabbit IgG (Heavy & Light Chain) antibody（antibodies-online Cat#ABIN101961）

驢抗兔IgG H&L （Abcam #ab6701）

山羊抗兔IgG H&L（Abcam #ab6702）

山羊抗兔IgG H&L（Yeasen #34850ES）

Rabbit anti-Mouse IgG (Heavy & Light Chain) Antibody（antibodies-online Cat#ABIN101785）

山羊抗小鼠IgG H&L（Abcam #ab6708）

山羊抗小鼠IgG H&L（Yeasen #34851ES）

• 關于文庫擴增

1. 本試劑盒中的文庫擴增組分由本公司高保真DNA聚合酶所組成，大大增強了擴增的均一性，即使是低拷貝的基因，也能進行無偏好性地擴增。

2. 推薦使用本公司的Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® (Yeasen Cat#12416)模塊進行文庫擴增，該模塊提供了384種不同組合的雙端index文庫制備引物，大程度上保證了文庫構建的穩(wěn)定性和重復性。

3. 對于PCR循環(huán)數(shù)，原則上在滿足上機的前提下，盡量降低擴增循環(huán)數(shù)。特別是少量細胞和低豐度蛋白，循環(huán)數(shù)不足，將導致文庫產(chǎn)量低；循環(huán)數(shù)過多，將導致文庫偏好性增加、重復度增加、大片段增多、嵌合產(chǎn)物增加、擴增突變累積等多種不良后果。表2以293T細胞為例，使用中高豐度表達的組蛋白(如H3K4me3、 H3K27me3)進行CUT&Tag實驗，細胞投入量、擴增循環(huán)數(shù)與文庫產(chǎn)量之間的關系如下表所示： 

表2細胞投入量與擴增循環(huán)數(shù)推薦表（H3K4me3/H3K27me3）*

【注】：*由于不同靶蛋白的表達量、DNA結合能力差異較大。實驗中需根據(jù)建庫起始細胞量、蛋白類型、細胞類型和樣本處理情況適當調整擴增循環(huán)數(shù)。推薦在PCR之前使用qPCR的方法對轉座酶插入的片段進行初步定量判斷再決定循環(huán)數(shù)。

4. 本試劑盒適用的細胞投入量為100-100,000個，受細胞類型、抗體選擇以及目的蛋白表達豐度的影響，實驗中可以兼容的細胞投入量并不是固定的，早期實驗時建議投入10,000-100,000個細胞，待獲得較理想的結果后，再探索低起始細胞量，細胞量低于10 K時，由于細胞容易損失，實驗成功率會降低，建議增加重復組數(shù)量。

• 關于DNA標準品

 DNA Spike-in Mix（5 ng/μL）是來源于大腸桿菌 Lambda DNA的三段序列，長度分別為230 bp、250 bp和300 bp，摩爾濃度比約為1：3：10(見圖1)。標準品主要用于在不同處理條件下或者不同細胞狀態(tài)下測序數(shù)據(jù)Normalization和定量分析。本試劑盒中提供的DNA Spike-in濃度為5 ng/μL，推薦添加量為5 pg/10萬（每10 w 細胞建議用TE buffer稀釋1000倍加1 μL），根據(jù)實際細胞投入量將DNA Spike-in梯度稀釋后添加，也可根據(jù)靶蛋白的結合DNA能力和豐度自行調整。標準品序列： 

Spike-in-1: GTTCCACTCCTGAAGTGTCAAGTACATCGCAAAGTCTCCGCAA

TTACACGCAAGAAAAAACCGCCATCAGGCGGCTTGGTGTTCTTTCAGTTCTT

CAATTCGAATATTGGTTACGTCTGCATGTGCTATCTGCGCCCATATCATCCAGT

GGTCGTAGCAGTCGTTGATGTTCTCCGCTTCGATAACTCTGTTGAATGGCTCT      

CCATTCCATTCTCCTGTGACTCGGAAGT

Spike-in-2: AGTCGGTGTGAATCCCATCAGCGTTACCGTTTCGCGGTGCTTC

TTCAGTACGCTACGGCAAATGTCATCGACGTTTTTATCCGGAAACTGCTGTCT         

GGCTTTTTTTGATTTCAGAATTAGCCTGACGGGCAATGCTGCGAAGGGCGTTT    

TCCTGCTGAGGTGTCATTGAACAAGTCCCATGTCGGCAAGCATAAGCACACA

GAATATGAAGCCCGCTGCCAGAAAAATGCATTCCGTGGTTGTCATACCT

Spike-in-3: CCTTACTGGAATCGATGGTGTCTCCGGTGTGAAAGAACACCAACAGGGGTGTTACCACTACCGCAGGAAAAGGAGGACGTGTGGCGAGACAGCGACGAAGTATCACCGACATAATCTGCGAAAACTGCAAATACCTTCCAACGAAACGCACCAGAAATAAACCCAAGCCAATCCCAAAAGAATCTGACGTAAAAACCTTCAACTACACGGCTCACCTGTGGGATATCCGGTGGCTAAGACGTCGTGCGAGGAAAACAAGGTGATTGACCAAAATCGAAGTTACGAACAAGAAAGCGTCGA