溶藻弧菌染料法熒光定量PCR試劑盒

Vibrio alginolyticus

產(chǎn)品及特點(diǎn)

巨細(xì)胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）是一種皰疹病毒組 DNA 病毒。亦稱細(xì)
胞包涵體病毒，由于感染的細(xì)胞腫大，并具有巨大的核內(nèi)包涵體。巨細(xì)胞病毒分布廣泛，其他動(dòng)物皆可遭受感染，引起以生殖泌尿系統(tǒng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟疾患為主的各系統(tǒng)感染，從輕微無(wú)癥狀感染直到嚴(yán)重缺陷或死亡。對(duì)于孕婦或有慢性消耗性疾病、免疫力低下等患者要注意保護(hù)。本公司開(kāi)發(fā)巨細(xì)胞病毒染料法熒光定量PCR試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開(kāi)即用，用戶只需要提供 DNA 模板。

2. 特異性高，引物是根據(jù)鸚鵡熱衣原體高度保守區(qū)設(shè)計(jì),不會(huì)擴(kuò)增其他微生物。

3. 引物和擴(kuò)增體系經(jīng)過(guò)優(yōu)化，靈敏性比常規(guī) PCR 高 100 倍。

4. 提供無(wú)傳染性的 PCR 陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

5. 一管式操作，熒光 PCR 檢測(cè)，不容易產(chǎn)生環(huán)境污染。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研，本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的 PCR。

溶藻弧菌染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。

自備試劑   樣品 DNA。

使用方法 一、稀釋PCR陽(yáng)性對(duì)照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）
1.注意：由于陽(yáng)性對(duì)照濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供可以直接使用的DNA段作為陽(yáng)性對(duì)照。
2.標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
3.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4.在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
5.換槍頭，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
6.換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照到5號(hào)管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
7.重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
8.如果有N個(gè)樣品，必須設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?0μL PCR陽(yáng)性對(duì)照的10000倍稀釋的（稀釋后濃度為1×10E4拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬(wàn)拷貝，可以將10μL原液加入到990μL 自備TE溶液中，充分混勻，此為100倍稀釋液。再取10μL此稀釋液加入到990μL 自備TE溶液中，充分混勻，此為10000倍稀釋液）再加上一定量的水作為制備的陽(yáng)性對(duì)照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫?duì)照。制備所得成為樣品DNA。
9.用自選方法純化N+2個(gè)樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20 μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）
10.如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于PCR陽(yáng)性對(duì)照（用第4號(hào)陽(yáng)性對(duì)照稀釋液，濃度為14810拷貝/μL）。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把6個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)縮減成1個(gè)，其余不變。
11.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后后加）：

12.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

四、數(shù)據(jù)處理
13.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品cDNA濃度的log值，再推算出其濃度。
14如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于36。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct大于或等于36則為陰性，如果小于或等于35則為陽(yáng)性。如果在35-36之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于36則為陰性，如果小于35，則為陽(yáng)性