Human IRAK3 ELISA Kit

檢測原理: 
本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗人IRAK3抗體包被于酶標板上，實驗時樣品或標準品中
的人IRAK3會與包被抗體結合，游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗人IRAK3抗體和辣根
過氧化物酶標記的親和素。抗人IRAK3抗體與結合在包被抗體上的人IRAK3結合、生物素與親和
素特異性結合而形成免疫復合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過氧化
物酶的催化下呈現(xiàn)藍色，加終止液后變成黃色。用酶標儀在450nm波長處測OD值，IRAK3濃度
與OD450值之間呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣品中IRAK3的濃度。 
樣品收集: 
1. 血清：全血樣品于室溫放置2小時或4℃一夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集
血液的試管應為一次性的無熱原，無內毒素試管。 
2. 血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內于1000×g離心15分鐘，取上清即可
檢測。避免使用溶血，高血脂樣品。 
3. 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會
影響測量結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體
積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調整，并做好記錄。
推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組
織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。zui后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，
取上清檢測。 
4. 細胞培養(yǎng)上清：取細胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質及細胞碎片。取上清檢測。 
5. 其它生物樣品：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測  
6. 樣品應清澈透明，懸浮物應離心去除。 
7. 樣品收集后若在1周內進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍
存于-20℃(1個月內檢測)，或-80℃（6個月內檢測），避免反復凍融。 
8. 如果您的樣品中檢測物濃度高于標準品zui高值，請根據(jù)實際情況，做適當倍數(shù)稀釋（建議先
做預實驗，以確定稀釋倍數(shù)）。 
 
試驗所需自備物品: 
1. 酶標儀(450nm波長濾光片) 
2. 高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL 
3. 37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水 
4. 吸水紙 
 
檢測前準備工作: 
1. 請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。 
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結
晶，屬于正常現(xiàn)象，可用40℃水浴微加熱使結晶*溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超
過50℃，使用時洗滌液應為室溫）。當日使用。 
3. 標準品: 于10000×g離心1分鐘，加入標準品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標準品中，旋緊管蓋，
靜置10分鐘，上下顛倒數(shù)次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為50ng/mL）。
然后根據(jù)需要進行倍比稀釋（注：不要直接在反應孔中進行倍比稀釋）。建議配制成以下濃
度：50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0ng/mL，標準品&樣品稀釋液直接作為空
白孔0ng/mL。如配制25ng/mL標準品：取0.5mL50ng/mL的上述標準品加入含有0.5mL標準品
&樣品稀釋液的EP管中，混勻即可，其余濃度依此類推。  
4. 生物素化抗體工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應多配
制100-200μL。使用前15分鐘，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作
濃度。當日使用。 
5. 酶結合物工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應多配制
100-200μL。使用前15分鐘，以酶結合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結合物(1:100)成工作濃度。
當日使用。 
標準品稀釋方法圖例：（以500μL/管為例，也可根據(jù)實際用量來稀釋，如200μL/管） 
 
 1 2 3 4 5 6 7 8 Tube 
 50 25 12.5 6.25 3.125 1.563 0.781 0 ng/mL 
 
洗滌方法: 
1. 自動洗板機：每孔加入洗滌液350μL，注入與吸出間隔60秒。 
2. 手工洗板：甩盡孔內液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350μL，浸泡1-2分鐘，吸
去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體，在厚的吸水紙上拍干。 
 
操作步驟: 
實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，并盡量避免起泡。 
1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加標準品&樣品稀釋液 100μL，余孔分
別加標準品或待測樣品 100μL，注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸
及孔壁，輕輕晃動混勻。給酶標板覆膜，37℃孵育 90 分鐘。為保證實驗結果有效性，每次
實驗請使用新的標準品溶液。 
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每個孔中加入生物素化抗體工作液 100μL（在使用前 15 分鐘
內配制），酶標板加上覆膜，37℃溫育 1 小時。 
3. 棄去孔內液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分鐘，大約 350μL/每孔，甩干并在吸水紙
上輕拍將孔內液體拍干。 
4. 每孔加酶結合物工作液（臨用前 15 分鐘內配制）100μL，加上覆膜，37℃溫育 30 分鐘。 
5. 棄去孔內液體，甩干，洗板 5 次，方法同步驟 3。 
6. 每孔加底物溶液(TMB)90μL，酶標板加上覆膜 37℃避光孵育 15 分鐘左右（根據(jù)實際顯色情 
況酌情縮短或延長，但不可超過 30 分鐘。當標準孔出現(xiàn)明顯梯度時，即可終止）。 
7. 每孔加終止液 50μL，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液
的加入順序相同。 
8. 立即用酶標儀在 450nm 波長測量各孔的光密度（OD 值）。應提前打開酶標儀電源，預熱儀
器，設置好檢測程序。 
9. 實驗完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存。 
 
注意事項： 
1. 保存：試劑盒中各試劑請按說明書提示合理存放。在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強
光中。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，否則可能會出現(xiàn)錯誤的結果。 
2. 酶標板：剛開啟的酶標板孔中可能會有少許水樣物質，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結果造成
任何影響。暫時不用的板條應拆卸后放入備用鋁箔袋，按推薦溫度存放！ 
3. 加樣：加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔的加樣時間間隔如果太大，將會導致不同的
“預溫育"時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。每次的加樣時間控制在
10分鐘內。推薦設置復孔。 
4. 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時必須給酶標板覆膜；洗板后應盡快進行下步操作，避免酶標
板處于干燥狀態(tài)；嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。 
5. 洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在吸水紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸
水。在讀數(shù)前要注意清除底部殘留的液體和手指印，以免影響酶標儀讀數(shù)。 
6. 試劑配制：Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate體積較
小，運輸過程會使液體沾到管壁或瓶蓋，因此使用*0轉/分離心1min，以使附著管壁或瓶
蓋的液體沉積到管底。取用前，請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。標準品、生物素化抗
體工作液、酶結合物工作液請根據(jù)所需用量配制，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆。請
配制標準品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取Concentrated Biotinylated Detection 
Ab時，一次不要小于10μL），以避免由于不準確稀釋而造成濃度誤差；請勿重復使用已稀釋
過的標準品、生物素化抗體工作液、酶結合物工作液。若需要分次使用標準品應按照每一次
用量分裝，將其放在-20～-80℃貯存。避免反復凍融。 
7. 顯色時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如每隔5分鐘），如梯度已很
明顯，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應，避免顏色過深影響酶標儀讀數(shù)。 
8. 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。 
9. 混勻：充分輕微混勻對反應結果尤為重要，使用微量振蕩器(使用zui低頻率)，如無微量
振蕩器，可在反應前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。 
10. 安全：試驗中請穿著實驗服并帶乳膠手套做好防護工作。特別是檢測血液或者其他體液樣品
時，請按國家生物試驗室安全防護條例執(zhí)行。 
11. 不同批號的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應終止液除外） 
12. 試驗中所用的EP管和吸頭均為一次性使用，嚴禁混用，否則將影響試驗結果！ 
結果判斷: 
1. 每個標準品的OD值減去空白孔的OD值后作圖，如設置復孔，則應取其平均值計算。以標準
品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪出標準曲線。亦可以OD值為橫坐標，標準品的濃度
為縱坐標，繪出標準曲線。 
2. 推薦使用專業(yè)的曲線制作軟件，如curve expert 1.3或1.4，在軟件界面既可根據(jù)樣品OD值，
由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；亦可將樣品的OD值代入標準曲線的擬合方程
式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。 
3. 若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數(shù)。 
 
靈敏度、檢測范圍、特異性和重復性: 
●靈敏度：zui小可測 0.469ng/mL。 
●檢測范圍：0.781–50ng/mL。 
● 特異性：可檢測重組或天然的人 IRAK3，且與其它相關蛋白無交叉反應。 
● 重復性：板內，板間變異系數(shù)均<10%。 
操作概要 
1. 在各孔中加入標準品或樣品各 100μL， 37℃孵育 90 分鐘 
2. 倒去孔內液體，加入 100μL 生物素化抗體工作液，37℃孵育 60 分鐘 
3. 洗滌 3 次 
4. 加入 100μL 酶結合物工作液， 37℃孵育 30 分鐘 
5. 洗滌 5 次 
6. 加入 90μL 底物溶液， 37℃孵育 15 分鐘左右 
7. 加入 50μL 終止液，立即在 450nm 波長處測量 OD 值 
8. 結果計算