冷凍干燥中的保護(hù)劑

冷凍干燥簡(jiǎn)稱凍干是將需要干燥的藥物溶液預(yù)先凍結(jié)成固體然后在低溫低壓條件下從凍結(jié)狀態(tài)不經(jīng)過(guò)液 態(tài)而直接升華除去水分的一種干燥方法由于整個(gè)操作過(guò)程都處于低溫狀態(tài)故這種方法尤其適用于熱敏性蛋白質(zhì)藥物制劑的制備。而凍干后的蛋白質(zhì)藥物呈疏松狀餅塊樣，不僅有利于保存而且有利于蛋白質(zhì)藥物重溶后的復(fù)性。顯然，凍干技術(shù)為理化性質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)藥物制劑提供了一種有效的制備方法然而凍干過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的相變過(guò)程，在凍結(jié)、凍融、干燥和儲(chǔ)存過(guò)程中存在著多種誘導(dǎo)藥品中蛋白質(zhì)變性的因素，故常需使用一些保護(hù)劑來(lái)穩(wěn)定處方中的蛋白質(zhì)。凍干保護(hù)劑的種類繁多，機(jī)制復(fù)雜，為了對(duì)此有更深入細(xì)致的了解，更為合理的使用這些輔料及制備出高質(zhì)量的凍干產(chǎn)品，本文就近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)蛋白質(zhì)凍干制品保護(hù)劑作一綜述。

凍干制品的整個(gè)凍干過(guò)程存在著各種各樣的應(yīng)力，通常包括低溫應(yīng)力、凍結(jié)應(yīng)力（包括枝狀冰晶的形成、離子強(qiáng)度的增加、PH值的改變、相分離等）、干燥應(yīng)力（移去蛋白質(zhì)表面單層水分子）等，這些應(yīng)力常常是直接或間接導(dǎo)致蛋白質(zhì)藥物不穩(wěn)定的因素。根據(jù)保護(hù)劑對(duì)抗應(yīng)力的不同可把蛋白質(zhì)保護(hù)劑初步分為冷凍保護(hù)劑和凍干保護(hù)劑。一個(gè)優(yōu)良的蛋白質(zhì)保護(hù)劑不僅能夠在整個(gè)凍干過(guò)程中對(duì)蛋白質(zhì)藥物起到良好的保護(hù)作用，而且能夠?qū)Τ善焚A藏期內(nèi)蛋白質(zhì)藥物的變性起到抑制作用，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)藥物在貯藏期的變性率往往比在凍干過(guò)程中的變性率要大，然而，多數(shù)在溶液中很有效的蛋白質(zhì)冷凍保護(hù)劑種類對(duì)干燥態(tài)的蛋白質(zhì)并無(wú)保護(hù)作用，甚至還會(huì)加速蛋白質(zhì)藥物的不穩(wěn)定化，例如，在PH5的10mmol/L醋酸鈉溶液中，加入CaCl2能能夠提高胰膚酶的穩(wěn)定性，但同時(shí)會(huì)增加蛋白質(zhì)凍干餅塊的塌陷及蛋白質(zhì)活性的丟失。而在干燥過(guò)程中對(duì)蛋白質(zhì)起保護(hù)作用的保護(hù)劑也可能對(duì)冷凍狀態(tài)下的蛋白質(zhì)起不到任何保護(hù)效果，為了擴(kuò)大保護(hù)作用，常常需要在凍干制品中使用兩種類型以上的保護(hù)劑常用的保護(hù)劑種類有多羥基化合物、糖、蛋白質(zhì)、聚合物、氨基酸、鹽、胺、表面活性劑等。

1、多羥基化合物

多羥基化合物用作蛋白質(zhì)的抗凍劑由來(lái)已久，常見(jiàn)的該類凍干保護(hù)劑有甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇、硫醇、聚乙二醇等。甘油可促進(jìn)凍干處理的過(guò)氧化氫酶復(fù)性，且隨著甘油濃度上升至0.8%時(shí)過(guò)氧化氫酶能*復(fù)性。甘露醇不僅可作為優(yōu)良的骨架劑使用，而且在一些處方中它能夠兼作蛋白質(zhì)的凍干保護(hù)劑。甘露醇對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)作用與其濃度、形態(tài)結(jié)構(gòu)有關(guān)，而其濃度與結(jié)晶形態(tài)有時(shí)呈一定的關(guān)聯(lián)性。通常認(rèn)為無(wú)定型甘露醇具有使蛋白質(zhì)穩(wěn)定的作用而結(jié)晶態(tài)的甘露醇則失去保護(hù)功能；1%或更低濃度的甘露醇通過(guò)無(wú)定型結(jié)構(gòu)的形成而阻止蛋白質(zhì)藥物的聚集，但是高濃度的甘露醇則易于形成結(jié)晶態(tài)而促進(jìn)蛋白質(zhì)藥物的聚集。

2、糖

糖是zui常見(jiàn)、使用zui廣的一類凍干保護(hù)劑，是蛋白質(zhì)的非特異性穩(wěn)定劑，在凍干的各個(gè)階段（如冷凍、凍融及升華干燥等）均能對(duì)蛋白質(zhì)藥物起到一定的保護(hù)作用。糖的保護(hù)作用與其及蛋白質(zhì)的種類有關(guān)，而雙糖是研究zui多也*zui有效的保護(hù)劑，其中蔗糖是由一分子葡萄糖及一分子果糖所構(gòu)成的雙糖，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，多呈無(wú)定型結(jié)構(gòu)，對(duì)阻止蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)改變、凍干處理過(guò)程中及貯藏期內(nèi)蛋白質(zhì)的伸展和聚集起顯著作用。與蔗糖相比，海藻糖具有更高的玻璃化溫度、更低的引濕性、更不具有還原性，這些優(yōu)點(diǎn)均預(yù)示著海藻糖可能具有更廣闊的應(yīng)用前景。大分子糖對(duì)蛋白質(zhì)提供的保護(hù)作用似乎不及小分子糖 諸多的研究均顯示分子量大的多糖不是凍干保護(hù)劑的*選擇。但有些研究結(jié)果卻與此相反，如對(duì)大分子量菊糖的研究表明聚合度高于5.5-6.0的的菊糖對(duì)堿性磷酸酶的活性保護(hù)作用明顯高于海藻糖及低聚合度的菊糖。這說(shuō)明對(duì)多糖的保護(hù)作用不能一概而論。特別是在儲(chǔ)藏期，右旋糖酐等多糖可提高制品的玻璃化溫度，阻止因制品塌陷而誘導(dǎo)蛋白質(zhì)破壞。葡萄糖在凍干過(guò)程中可部分保持無(wú)定型，對(duì)某些蛋白質(zhì)藥物具有一定的保護(hù)作用，但應(yīng)該注意的是葡萄糖系還原性糖在選其作為蛋白質(zhì)的保護(hù)劑時(shí)要慎重。糖對(duì)蛋白質(zhì)保護(hù)作用大小有時(shí)依賴于其濃度，通常在某個(gè)濃度范圍內(nèi)糖的保護(hù)作用隨著濃度的升高而增大；當(dāng)達(dá)到某一濃度時(shí)保護(hù)作用達(dá)到zui大值，而此后再增大糖的濃度則保護(hù)效果不再顯著增加，有時(shí)反而會(huì)降低。對(duì)呈現(xiàn)zui大保護(hù)作用時(shí)糖的濃度其報(bào)道不一，如100mmol/L蔗糖對(duì)B-半乳糖配酶的保護(hù)效果，而對(duì)磷酸果糖激酶提供zui大保護(hù)作用的海藻糖濃度為300mg/ml，文獻(xiàn)報(bào)道糖獲得zui大穩(wěn)定作用的zui低濃度是其足夠在蛋白質(zhì)表面形成一個(gè)單分子層的濃度，實(shí)際上，糖對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)作用不僅取決于糖的總體濃度而且還與兩者的比例有關(guān)，有人研究發(fā)現(xiàn)a-D-吡喃甘露糖乳糖、海藻糖、纖維二糖等與重組人生長(zhǎng)激素的摩爾比為131：1時(shí)它們均能100%地占據(jù)重組人生長(zhǎng)激素上強(qiáng)及弱的水結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)其提供*的保護(hù)效果，當(dāng)摩爾比達(dá)300：1及1000：1時(shí)糖對(duì)重組人生長(zhǎng)激素的保護(hù)作用不再提高且在某些處方中保護(hù)作用甚至?xí)兴陆怠?/p>

糖的還原性及其它性質(zhì)（如旋光性）也會(huì)影響其對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)作用。葡萄糖、乳糖、麥芽糖、纖維二糖等還原性糖均有可能與蛋白質(zhì)上暴露的某些氨基酸殘基發(fā)生邁拉德反應(yīng)（即撥氨反應(yīng)或棕色反應(yīng)），使制品變黃和蛋白質(zhì)活性降低，旋光性不同的麥芽糖糊精在凍干過(guò)程中對(duì)乳酸脫氫酶的保護(hù)作用顯示出很大差異。

目前用作蛋白質(zhì)保護(hù)劑的糖有葡萄糖、a-D-吡喃甘露糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、纖維二糖、甘露糖、麥芽糖、肌糖、棉白糖、菊糖、右旋糖酐、麥芽糖糊精、麥芽多糖、八硫酸蔗糖、肝素、2-羥丙基-B環(huán)糊精等。盡管糖能夠?qū)Χ鄶?shù)蛋白質(zhì)提供可靠的保護(hù)作用，但并非所有的蛋白質(zhì)都能被糖所保護(hù)，這仍有待于更為細(xì)致深入的研究。

3、氨基酸

氨基酸是常見(jiàn)的蛋白質(zhì)保護(hù)劑之一，在冷凍過(guò)程中低濃度的甘氨酸可通過(guò)抑制10或100mmol/L磷酸緩沖鹽結(jié)晶所致PH值的改變而阻止蛋白質(zhì)藥物變性。無(wú)定型甘氨酸可阻止凍干過(guò)程中重組人生長(zhǎng)激素的聚集；結(jié)晶型甘氨酸能升高成品的塌陷溫度阻止因塌陷而引起的蛋白質(zhì)藥物的破壞常用的氨基酸類蛋白質(zhì)保護(hù)劑有脯氨酸、色氨酸、谷氨酸鈉、丙氨酸、甘氨酸、賴氨酸鹽酸鹽、肌氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等。

4、聚合物

聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、明膠、聚乙烯亞胺等聚合物也常用作為蛋白質(zhì)的冷凍保護(hù)劑。通常聚合物的穩(wěn)定作用取決于聚合物的多重性質(zhì)，如優(yōu)先從蛋白質(zhì)表面析出、表面活性、使蛋白質(zhì)溶液黏度升高從而阻止其他小分子（如糖及多輕基化合物）的結(jié)晶、抑制冷凍過(guò)程中PH值的劇烈變化等。不同聚合度及濃度的聚合物所提供的保護(hù)作用不同，如聚合度大的PVP有著較高的玻璃化溫度，隨著PVP濃度及分子量增加，水溶液的黏度隨之變大，蔗糖的玻璃化溫度明顯升高，對(duì)冷凍過(guò)程中的蛋白質(zhì)所起的保護(hù)作用隨之也有所增加；但聚合度過(guò)大時(shí)，聚合物會(huì)在冷凍過(guò)程中結(jié)晶，從而失去對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)作用，而且濃度及分子量過(guò)大時(shí)會(huì)增加zui終產(chǎn)品的水分，使得制品中蛋白質(zhì)變得更不穩(wěn)定。右旋糖酐40對(duì)豬的胰蛋白酶穩(wěn)定作用比右旋糖酐80強(qiáng)，提示聚合物合適的鏈長(zhǎng)有利于胰蛋白酶的穩(wěn)定。

5、蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)類保護(hù)劑可分為兩種：一種是蛋白質(zhì)藥物自身，另一種為外來(lái)蛋白質(zhì)。一些蛋白質(zhì)經(jīng)凍融后的活性直接和蛋白質(zhì)的起始濃度有關(guān)，起始濃度升高有時(shí)會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)的復(fù)性。一種常用的外來(lái)蛋白質(zhì)類保護(hù)劑為血清白蛋白，它是一個(gè)經(jīng)典、優(yōu)良的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。例如，冷凍時(shí)1% 牛血清白蛋白可使兔肌肉乳酸脫氫酶水溶液的活性不受損失；人血清白蛋白則在更低濃度（0.05%-0.1%）時(shí)也能有效阻止蛋白質(zhì)表面的吸附，對(duì)凍干過(guò)程中多數(shù)蛋白都具有保護(hù)作用，因而常用于白細(xì)胞介素、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）等疏水性細(xì)胞因子凍干處方中。然而，由于血清白蛋白潛在的血源性病原體污染限制了其在蛋白產(chǎn)品中的應(yīng)用。已有人把重組人白蛋白推薦為血清白蛋白的替代品。

6、其它

吐溫80、布里杰、普朗尼克及十二烷基磺酸鈉等一些表面活性劑有時(shí)對(duì)冷凍及干燥過(guò)程中的蛋白質(zhì)起到一定的保護(hù)作用。在某些凍干制品中，加入鹽和胺可獲得特定的蛋白質(zhì)穩(wěn)定化效果。聯(lián)合使用不同類型的保護(hù)劑可獲得穩(wěn)定性更佳的凍干制品。

如何獲得穩(wěn)定的蛋白質(zhì)凍干制品，選擇適宜的保護(hù)劑至關(guān)重要。那么如何去選擇適宜的保護(hù)劑呢？首先要對(duì)被保護(hù)的蛋白質(zhì)藥物理化特性有一個(gè)充分的了解，繼而再通過(guò)試驗(yàn)摸索出在凍干過(guò)程及貯藏過(guò)程中導(dǎo)致該蛋白質(zhì)藥物不穩(wěn)定的因素，然后針對(duì)這些不穩(wěn)定因素選擇具體的保護(hù)劑一般而言，糖及多羥基化合物是zui常用的凍干保護(hù)劑，其中蔗糖 海藻糖等雙糖對(duì)一些蛋白質(zhì)均能顯示出良好的保護(hù)作用，故在選擇凍干保護(hù)劑時(shí)應(yīng)優(yōu)先考慮。一個(gè)優(yōu)良的凍干保護(hù)劑應(yīng)該具備多種保護(hù)特性，如高的玻璃化溫度 低的吸濕性能 低的結(jié)晶速率 及不具有還原性基團(tuán)等。但任何單一保護(hù)劑都不可能具有所有的保護(hù)特性，因此有時(shí)還得考慮使用2種或2種以上的保護(hù)劑來(lái)穩(wěn)定蛋白質(zhì)藥物。

結(jié) 語(yǔ)

隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，越來(lái)越多的蛋白質(zhì)藥物被開(kāi)發(fā)出來(lái)。截至目前為止除了采用凍干技術(shù)外尚無(wú)更有效的制劑手段可用來(lái)制備較為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)產(chǎn)品，即便采用凍干技術(shù)制備某些蛋白質(zhì)產(chǎn)品仍需要采取一些有效的輔助手段，如加入凍干保護(hù)劑以增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。近些年來(lái)凍干保護(hù)劑及其保護(hù)機(jī)制研究更加深入。特別是蛋白質(zhì)分析手段的提高為蛋白質(zhì)保護(hù)劑的研究提供了方便，計(jì)算機(jī)技術(shù)在凍干過(guò)程中的應(yīng)用使得能夠建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型對(duì)凍干過(guò)程中物料的真實(shí)狀態(tài)進(jìn)行模擬解析，從而也使得凍干技術(shù)得以完善與提高。但蛋白質(zhì)的穩(wěn)定機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，對(duì)蛋白質(zhì)凍干制品的研究有待進(jìn)一步的深化。開(kāi)發(fā)更*的凍干保護(hù)劑，提高蛋白質(zhì)藥物凍干制品的質(zhì)量仍是現(xiàn)今生物技術(shù)藥物研究的重點(diǎn)與方向。